單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析促進(jìn)了大腦中的細(xì)胞類型鑒別和細(xì)胞類型特異性連接組的繪制，有助于闡明大腦功能的神經(jīng)回路并通過神經(jīng)調(diào)控治療大腦疾病。然而，我們?nèi)狈ι窠?jīng)元類型/亞型有共識的定義，也缺乏復(fù)雜互連網(wǎng)絡(luò)中因果關(guān)系的明確理解。

2022年6月21日，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦技術(shù)中心蒲慕明在Cell發(fā)表題為“Transcriptome, connectome and neuromodulation of the primate brain”的評論文章，該文章重點(diǎn)關(guān)注靈長類動物大腦的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和連接組學(xué)研究，以及通過物理手段進(jìn)行精確的神經(jīng)調(diào)控，旨在調(diào)控各種大腦功能和功能障礙背后的特定神經(jīng)回路。

自從 Ramon y Cajal 提出神經(jīng)元作為神經(jīng)系統(tǒng)的基本單位以來，識別所有神經(jīng)元類型并繪制它們在大腦中的連接圖譜一直是神經(jīng)生物學(xué)家迫在眉睫的任務(wù)?；诩?xì)胞形態(tài)、電生理特性、基因表達(dá)譜和連接模式對細(xì)胞類型進(jìn)行分類的多種方法已經(jīng)產(chǎn)生了大量信息。單細(xì)胞 RNA 測序技術(shù)的最新進(jìn)展極大地加快了基于轉(zhuǎn)錄組的細(xì)胞分類的步伐。細(xì)胞類型特異性病毒載體和光學(xué)成像技術(shù)的出現(xiàn)還允許繪制介觀神經(jīng)連接組（mesoscopic connectomes），包括軸突全腦的投射模式（“投射組”）和單個(gè)神經(jīng)元所接收的所有輸入神經(jīng)連接（“輸入組”）。在基于轉(zhuǎn)錄組和基于連接組的分類中，細(xì)胞類型的數(shù)量隨著分析的分辨率而增加，因此最終每個(gè)細(xì)胞都可能成為自成一類。這就需要我們對定義細(xì)胞類型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成共識，最好是一種可以整合各種分類方案所獲信息的標(biāo)準(zhǔn)。

盡管目前尚未就細(xì)胞分型標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成共識，但在過去十年中，在研究小鼠大腦的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和連接組以及來自表觀基因組、生理和行為研究的信息方面已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展?？茖W(xué)家們正在努力將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究從小鼠擴(kuò)展到非人類靈長類動物 (Non-human primate, NHP) 和人類大腦。然而，在 NHP 中繪制單細(xì)胞連接組仍處于早期階段。本評論重點(diǎn)關(guān)注靈長類動物大腦的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和連接組學(xué)研究，以及通過物理手段進(jìn)行精確的神經(jīng)調(diào)控，旨在調(diào)控各種大腦功能和功能障礙背后的特定神經(jīng)回路的活動。

靈長類大腦的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組

現(xiàn)在正在從 NHP 和人類大腦中獲得有關(guān)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的大量數(shù)據(jù)。在胚胎和成年小鼠和人類大腦的同源區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了保守和差異的基因表達(dá)模式。與小鼠一樣，需要整合靈長類動物大腦中形態(tài)、電生理特性和基因表達(dá)模式的單細(xì)胞數(shù)據(jù)。針對于人類皮層內(nèi)的谷氨酸能神經(jīng)元，Berg 等人確實(shí)發(fā)現(xiàn)了它們的轉(zhuǎn)錄組模式和形態(tài)以及生理特性之間的一些對應(yīng)關(guān)系。隨著這項(xiàng)工作的進(jìn)一步進(jìn)展，我們越來越需要統(tǒng)一定義細(xì)胞類型和亞型，這可以作為整合各種分類方法所獲信息的基礎(chǔ)。

一種神經(jīng)元類型或亞型應(yīng)該有一些獨(dú)特的特征為標(biāo)志， 而這些特征在整個(gè)神經(jīng)元的整個(gè)生命周期中都必須相對穩(wěn)定；而在短時(shí)間尺度上持續(xù)的基因表達(dá)、生理特性和形態(tài)/連接性的變化可以被認(rèn)為是神經(jīng)元的不同狀態(tài)。鑒定穩(wěn)定且獨(dú)特表達(dá)的基因?qū)⒂兄诙x細(xì)胞類型，但迄今大多數(shù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析一般都缺少有關(guān)轉(zhuǎn)錄組模式的時(shí)間變化的信息。已知在早期神經(jīng)發(fā)生過程中不同轉(zhuǎn)錄因子組的表達(dá)決定了主要神經(jīng)元類型的命運(yùn)，即谷氨酸能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元和調(diào)質(zhì)神經(jīng)元。通過對祖細(xì)胞進(jìn)行并行標(biāo)記以跟蹤小鼠前腦發(fā)育過程中的譜系關(guān)系和轉(zhuǎn)錄組特征，Bandler 等人2022 年發(fā)現(xiàn)皮質(zhì) GABA 能亞型的分化是在祖細(xì)胞水平的就可以表現(xiàn)出不同。目前尚不清楚每種主要神經(jīng)元類型的祖細(xì)胞群內(nèi)的異質(zhì)性在多大程度上可以解釋其后代的亞型多樣化，以及內(nèi)在的譜系依賴性規(guī)則是否在決定不同大腦區(qū)域的所有神經(jīng)元亞型中起主導(dǎo)作用。

我們可以合理地預(yù)期，分化的神經(jīng)元亞型的穩(wěn)定基因表達(dá)模式與其在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的功能要求應(yīng)該相匹配，而通常神經(jīng)元的功能常是由其特定的連接性來決定的，并且匹配過程始于有絲分裂后神經(jīng)元遷移到大腦中的指定位點(diǎn)并形成突觸連接。Shibata 等人2021 年在發(fā)育中的小鼠大腦中發(fā)現(xiàn)了視黃酸的前后腦區(qū)的梯度及其匹配受體的表達(dá)，并且視黃酸活性是建立丘腦皮質(zhì)連接所必需的。因此，早期神經(jīng)發(fā)生過程中時(shí)空編程的基因表達(dá)可能不但決定了有絲分裂后神經(jīng)元（Fishell 和 Heinz 所命名）的“基態(tài)”-定義了主要神經(jīng)元類型, 而且也指導(dǎo)了神經(jīng)元遷移、軸突/樹突生長和樹枝狀化，以及初始神經(jīng)元連接性。隨后與局部環(huán)境的相互作用以及依賴于電活動的神經(jīng)連接的修剪和鞏固化，會賦予其獨(dú)特形態(tài)和生理特征的神經(jīng)元亞型的穩(wěn)定基因表達(dá)的最終模式。因此，可以整合基于轉(zhuǎn)錄組和基于連接組的亞型分類的一種方式，就是在每種類型的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)一組獨(dú)特的、穩(wěn)定表達(dá)的基因，同時(shí)這些神經(jīng)元也表現(xiàn)出獨(dú)特的連接組模式。在靈長類動物新皮質(zhì)中，鑒于其祖細(xì)胞的長期增殖和更復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用和連接性，人們預(yù)計(jì)會出現(xiàn)比嚙齒動物更多的神經(jīng)元亞型。此外，基于穩(wěn)定性的神經(jīng)元類型/亞型分類標(biāo)準(zhǔn)必須能應(yīng)用于經(jīng)驗(yàn)帶來的長期記憶，因?yàn)檫@些記憶涉及長期穩(wěn)定的基因表達(dá)和突觸連接的改變。長期記憶，特別是那些潛在的靈長類大腦高級認(rèn)知功能，如面部識別和語言處理，是否涉及創(chuàng)建不同的神經(jīng)元亞型？

空間轉(zhuǎn)錄組分析的快速發(fā)展現(xiàn)在允許以單細(xì)胞分辨率繪制整個(gè)大腦的基因表達(dá)空間分布圖。大規(guī)模“stereo-Seq”技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于整個(gè)獼猴大腦，以確定皮層和皮層下大腦區(qū)域中各種以轉(zhuǎn)錄組模式定義的細(xì)胞類型的空間分布。這種空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析也將有應(yīng)用于手術(shù)獲得或尸檢的人腦組織，并提供更精確的特定基因表達(dá)的空間定位，這些信息理解人腦各種功能和功能障礙的基礎(chǔ)。結(jié)合組織學(xué)和基于 MRI 的信息，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析還可以幫助產(chǎn)生更精細(xì)的腦區(qū)分割，為繪制靈長類大腦中所有神經(jīng)元類型的神經(jīng)連接圖譜提供基礎(chǔ)。

在動物的整個(gè)生命周期中縱向進(jìn)行的空間轉(zhuǎn)錄組分析代表了一個(gè)很有意義的新研究方向，這將使我們能夠解決有關(guān)靈長類動物大腦進(jìn)化、發(fā)育和衰老的許多重要問題。為了回答這些問題，我們不僅需要鑒別在靈長類動物中特異表達(dá)的基因，還需要了解靈長類特異性的基因表達(dá)調(diào)控元件，這些元件決定了保守基因和靈長類特異性基因的獨(dú)特表達(dá)模式，以及它們對組織環(huán)境中細(xì)胞間相互作用和表觀遺傳因素的依賴性。人類大腦發(fā)育期延長、皮層褶皺的形態(tài)發(fā)生以及人類特定功能（例如語言）的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的形成，可以極大地受益于特定基因何時(shí)、何地以及如何表達(dá)的知識。其中一些問題可以通過將轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)應(yīng)用于 NHP 來解決。

靈長類動物大腦的介觀連接組

雖然人腦的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析可以在手術(shù)中獲取的樣本和尸檢組織上進(jìn)行，但人腦介觀連接組的映射要困難得多，在活的人腦組織中進(jìn)行細(xì)胞類型特異性探針的病毒表達(dá)以追蹤神經(jīng)元連接，以及高通量成像和在單細(xì)胞分辨率下大規(guī)模重建遠(yuǎn)程投射，都有極大的困難。NHP 中的介觀神經(jīng)連接組的繪制，例如狨猴和獼猴，目前較為現(xiàn)實(shí)。最近通過重建整個(gè)大腦超薄切片的熒光顯微圖像，或改良的光學(xué)透明組織塊的光片成像，已經(jīng)證實(shí)了獼猴大腦在微米分辨率下遠(yuǎn)程跟蹤單個(gè)神經(jīng)元投射的能力。每個(gè)獼猴大腦的數(shù)據(jù)采集和處理工作量巨大，但似乎在一個(gè)可行的范圍內(nèi)。另一方面，闡明不同大腦區(qū)域內(nèi)的局部網(wǎng)絡(luò)連接，繪制每種類型神經(jīng)元的輸入組，是更艱巨的挑戰(zhàn)。

以往的解剖學(xué)工作已經(jīng)使用逆行熒光珠對獼猴大腦中的皮質(zhì)-皮質(zhì)投射進(jìn)行了廣泛的研究。鑒定在 NHPs 的不同皮層區(qū)和大腦各區(qū)域內(nèi)不同細(xì)胞類型中差異表達(dá)的基因，以及進(jìn)一步闡明表達(dá)這些基因的特定的啟動子/增強(qiáng)子，將導(dǎo)致開發(fā)用于繪制細(xì)胞類型特異性神經(jīng)連接組的分子示蹤劑。這種連接組信息為進(jìn)一步研究與不同大腦功能相關(guān)的神經(jīng)元/回路特異性活動提供了基礎(chǔ)。宏觀腦成像（例如，磁共振成像、MRI）已經(jīng)在 NHP、正常人類受試者和腦部疾病患者中以毫米分辨率生成了有關(guān)結(jié)構(gòu)和功能連接性的大量信息。相對較低的空間和時(shí)間分辨率、圖像收集和分析程序的變化以及個(gè)體差異性限制了這些成像數(shù)據(jù)在臨床環(huán)境中的有用性。NHP 大腦的介觀連接組分析，結(jié)合先前對同一動物的結(jié)構(gòu)和 fMRI 成像，將有助于解釋從擴(kuò)散張量成像推斷出的宏觀“結(jié)構(gòu)連接組”。對特定大腦區(qū)域中特定神經(jīng)元類型活動的光學(xué)成像和光遺傳學(xué)操作將進(jìn)一步有助于解釋 MRI 研究推斷的“功能連接組”。

用于治療腦部疾病的神經(jīng)調(diào)節(jié)

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和連接組分析的普遍目標(biāo)是為監(jiān)測和操縱特定神經(jīng)元類型和回路的活動提供基礎(chǔ)。然而，大腦疾病特異性神經(jīng)元和回路難以識別，特別是對于自閉癥、抑郁癥和精神分裂癥等精神類疾病，這些疾病涉及隨個(gè)體遺傳背景和發(fā)育史而變化的網(wǎng)絡(luò)異常。在相互連接的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，特別是在關(guān)聯(lián)和額葉皮質(zhì)中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，很難破譯多個(gè)大腦區(qū)域相關(guān)活動之間的因果關(guān)系，也很難確定神經(jīng)回路是在主導(dǎo)還是僅僅調(diào)節(jié)特定的大腦功能。此外，異常的神經(jīng)回路源于神經(jīng)元的異常連接，而這些神經(jīng)元也包含在許多其他正常回路連接之中，因此靶向分子和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物必然具有非特異性回路作用。人們越來越希望通過物理、生理和心理手段調(diào)節(jié)功能失調(diào)的網(wǎng)絡(luò)（這里稱為“神經(jīng)調(diào)控（neuromodulation）”）可以提供腦部疾病的非藥物治療。

藥物或神經(jīng)調(diào)控方法的開發(fā)需要更合適的動物模型。迄今為止，一般是使用腦疾病的嚙齒動物模型對候選藥物進(jìn)行臨床前療效測試， 但最終能通過臨床試驗(yàn)的藥物很少。由于 NHP 在許多解剖學(xué)和生理學(xué)特征上與人類接近，使用狨猴和獼猴的疾病模型可能被證明是有價(jià)值且不可替代的。許多非侵入性神經(jīng)調(diào)控工具，例如經(jīng)顱磁刺激 (TMS)、直接或交流電刺激 (tDCS 或 tACS) 和超聲刺激具有較低的空間分辨率和較差的目標(biāo)特異性，這一問題可以通過使用較大尺寸的 NHP 大腦來部分解決。用于制作小鼠模型的轉(zhuǎn)基因和基因編輯方法現(xiàn)在正在擴(kuò)展到 NHP。最近的一個(gè)例子是通過刪除獼猴胚胎中的核心晝夜節(jié)律基因 BMAL1 產(chǎn)生的晝夜節(jié)律紊亂的獼猴模型。這些 BMAL1 缺失的猴子表現(xiàn)出多種癥狀，包括睡眠障礙、焦慮/抑郁樣行為和精神分裂癥樣腦電圖特征，目前正被用于測試藥物和神經(jīng)調(diào)節(jié)治療緩解特定精神疾病癥狀的功效。

理想情況下，使用神經(jīng)調(diào)控的臨床治療應(yīng)該基于對特定腦部疾病的特定功能障礙神經(jīng)元和回路的了解，目前這種情況在很大程度上是無法實(shí)現(xiàn)的。從另一方面來說，即使不知道大腦疾病的“原因”，也可以使用神經(jīng)調(diào)控來糾正“影響”（可觀察到的疾病表型），前提是原因和影響可能在復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中互為因果。例如，基于觀察到阿爾茨海默病 (AD) 小鼠模型中的伽馬振蕩減少，Martorell 等人2019 年實(shí)驗(yàn)表明，通過視覺或聽覺刺激誘導(dǎo)伽馬振蕩可以減少整個(gè)新皮層的淀粉樣蛋白斑塊并改善記憶功能。

使用侵入性（例如，深部腦刺激，DBS）和非侵入性（例如，tDCS 和 TMS）方法的臨床神經(jīng)調(diào)控研究表明，患者的治療效果存在很大差異，正如幾項(xiàng)關(guān)于 tDCS 治療中風(fēng)患者運(yùn)動缺陷的薈萃分析所表明的那樣。這種可變性可歸因于各種研究中使用的參數(shù)的差異，例如強(qiáng)度、時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和調(diào)控部位，以及患者特定的顱骨解剖和神經(jīng)回路差異。在神經(jīng)調(diào)控的臨床應(yīng)用中，調(diào)kong時(shí)機(jī)的重要性尚未得到足夠的重視。最近對獼猴中風(fēng)模型的一項(xiàng)研究表明，低頻硬膜外交流電刺激 (ACS) 會導(dǎo)致病灶周圍皮層中與任務(wù)相關(guān)的神經(jīng)元集群發(fā)生同步放電，從而提高了猴子在中風(fēng)后的抓握靈活性。這可歸因于在抓握運(yùn)動同時(shí)施加的 ACS 增強(qiáng)了抓握運(yùn)動的神經(jīng)回路。因此，當(dāng)與患者發(fā)起或治療觸發(fā)的目標(biāo)行為激活同時(shí)進(jìn)行時(shí)，相對非特異性的神經(jīng)調(diào)控可能會增強(qiáng)治療效果，即使確切的潛在神經(jīng)回路仍然不清楚。

考慮到顱骨解剖結(jié)構(gòu)和神經(jīng)回路配置的個(gè)體差異，需要對每個(gè)受試者大腦的影響進(jìn)行定量模擬或測量，以實(shí)現(xiàn)更精確和有效的神經(jīng)調(diào)制。例如，將臨床反應(yīng)映射到一系列焦點(diǎn)刺激可以幫助確定在使用 DBS 治療嚴(yán)重抑郁癥時(shí)有效的個(gè)性化刺激參數(shù)。在非侵入性 tCS 和 TMS 治療中，基于結(jié)構(gòu) MRI 數(shù)據(jù)的顱內(nèi)電場分布的個(gè)體特異性建?？梢愿_地識別電流幅度和調(diào)控的大腦區(qū)域，基于 EEG 的腦電微狀態(tài)分析可以提供調(diào)控所誘導(dǎo)的、在線監(jiān)測的大腦網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化。用計(jì)算建模輔助校準(zhǔn)刺激參數(shù)，以及基于調(diào)控引起的大腦狀態(tài)變化或個(gè)體患者的即時(shí)臨床反應(yīng), 在線式的調(diào)整參數(shù)，可以為治療腦部疾病提供有效的精確神經(jīng)調(diào)控。

來源：中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）

原標(biāo)題：《Cell | 蒲慕明發(fā)表靈長類大腦的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、連接組和神經(jīng)調(diào)控的文章》