1872年，亨廷頓病由美國醫(yī)學家喬治?亨廷頓首次發(fā)現(xiàn)并因此命名?；疾≌邥憩F(xiàn)出手舞足蹈狀，故又被稱為“致命的舞蹈”。

實際上，類似于阿爾茨海默癥（AD）、帕金森綜合征（PD）、肌萎縮性脊髓側索硬化癥（ASL）等，亨廷頓病是一種神經(jīng)退行性疾病。但和阿爾茨海默癥等疾病不同的是，亨廷頓病還是一種常染色體顯性遺傳疾病。這就意味著，只要父母一方患有疾病，子女就有50%的概率面臨相同的命運，甚至世世代代難以逃脫“魔咒”。

目前，該疾病沒有有效治療方法，“看著他走向死亡”是患者家屬的最后心路。過去的20年時間里，藥企進行了近百次臨床試驗，研究了治療亨廷頓癥的41種不同組合藥物，但只有2種藥物獲得許可，并且只能緩解癥狀。

最新的進展是，該疾病的大動物模型成功建立。北京時間3月30日，生物學頂級學術期刊《細胞》（Cell）在線發(fā)表了中國科學家的一項重大成果：首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術和體細胞核移植技術（SCNT），成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬，精準地模擬出人類神經(jīng)退行性疾病。2個月以前，中國科學家獲得全球首個體細胞克隆猴的成果也發(fā)表在該期刊。

論文共同通訊作者為暨南大學粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院李曉江教授、中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學研究員、美國埃默里大學李世華教授。李曉江是亨廷頓病研究領域的權威，于2008年和李世華在世界上首次利用轉(zhuǎn)基因的方法建立了非人靈長類的亨廷頓疾病猴模型。賴良學則長期從事豬等大型哺乳動物的克隆，2010年和李曉江、李世華合作建立了首例轉(zhuǎn)基因亨廷頓舞蹈病的豬模型。

賴良學在接受澎湃新聞（www.loaarchitects.com.cn）采訪時表示，“過去長期存在的問題是，我們用轉(zhuǎn)基因克隆技術試圖建立亨廷頓病的大動物模型，但轉(zhuǎn)基因的缺點是基因插入位置無法控制、表達量也無法控制，因此此前轉(zhuǎn)基因克隆獲得的豬或者猴子都存活不了幾天，準確來說無法稱之為模型?！?/p>

賴良學提到，2013年CRISPR/Cas9基因編輯技術的問世，讓這項亨廷頓病動物模型的研究工作出現(xiàn)曙光。研究團隊再次投入了長達4年的時間，最終獲得這份成果。

著名的細胞生物學家、原同濟大學校長、中科院院士裴鋼表示，2008年，我們在制定發(fā)育與生殖研究國家重大科學研究計劃"十二五"專項規(guī)劃時，就前瞻性地布局了大型實驗動物模型包括豬和猴的培育內(nèi)容，并在后來的“干細胞國家重大科學研究計劃”中持續(xù)加大經(jīng)費投入。

裴鋼評價，我國在基因編輯猴和克隆猴的研究中相繼取得突破性成果，這次我國科學家在豬的疾病模型研究中又取得重大進展，表明我國在大動物模型的研究中已走在世界前列，將極大地推動我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展。

從事多年亨廷頓病研究的權威專家、美國加州大學洛杉磯分校楊向東教授也指出，亨廷頓舞蹈病基因敲入豬的建立是神經(jīng)退行性疾病研究領域中的一個里程碑式的發(fā)現(xiàn)，使科學家能更深入了解神經(jīng)細胞死亡的機制及尋找有效的治療方法。

定點敲入人致病基因

亨廷頓病的病因是，患者體內(nèi)的亨廷頓基因外顯子1發(fā)生了CAG三核苷酸重復突變，進而引發(fā)其編碼的亨廷頓蛋白（HTT）多聚谷氨酰胺（polyQ）序列延長所致。實際上，除亨廷頓病之外，多聚谷氨酰胺序列延長還會導致其他至少8種神經(jīng)退行性疾病，包括脊髓小腦共濟失調(diào)、脊髓延髓肌肉萎縮癥（肯尼迪?。┑取?/p>

值得一提的是，亨廷頓病是由單基因突變導致的神經(jīng)退性疾病，這使之成為一個理想的疾病模式，可用于研究蛋白質(zhì)錯誤折疊如何引起選擇性的神經(jīng)退性病變，也是以后研究多基因突變病癥的基礎。

研究團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯技術將人突變的亨廷頓基因，即人外顯子1中包含150 CAG重復序列精確地插入豬的亨廷頓蛋白內(nèi)源性基因中。研究團隊通過PCR篩選了2430個融水胎兒豬成纖維細胞，最終確定了9個陽性克隆細胞。

研究團隊挑選了其中一個細胞克隆株用于體細胞核移植，最終獲得2880個胚胎。這些胚胎被轉(zhuǎn)移至16頭代孕豬，其中10頭代孕豬懷孕成功，排除流產(chǎn)后獲得了7頭自然產(chǎn)下的小豬。

PCR基因型分析和DNA測序結果顯示，共有6頭豬攜帶了擴展CAG重復的人類亨廷頓蛋白外顯子1。這6頭豬即被稱為F0代。

隨后，研究團隊用F0代母豬和野生型公巴馬香豬交配，獲得F1代豬。F1代公豬和野生型母巴馬香豬交配，獲得F2代豬。論文中數(shù)據(jù)顯示，過去的兩年時間里，研究團隊通過這種繁殖方式，獲得了15頭F1代豬和10頭F2代豬，全都呈現(xiàn)突變亨廷頓蛋白陽性。

賴良學告訴澎湃新聞，“論文發(fā)表之后，還在繼續(xù)產(chǎn)生后代，現(xiàn)在所有的基因敲入豬加起來，差不多有近50頭了?！?p>

賴良學強調(diào)，“以前用轉(zhuǎn)基因技術將外源基因轉(zhuǎn)進去之后，豬本身的亨廷頓蛋白也在同時起作用，這次通過基因編輯敲入，豬本身基因是破壞掉的。這樣，豬本身的亨廷頓基因就不會表達了，純粹表達人致病基因。結果出來的癥狀、病理變化都是跟自然發(fā)生的是一致的?！?/p>

癥狀、病理與人類似

亨廷頓病主要特點是軀體和四肢不可控制地舞蹈樣運動，漸進性認知能力下降和精神障礙，主要病理特征則為大腦紋狀體區(qū)中型棘突神經(jīng)元（MSN）逐漸丟失。

論文中數(shù)據(jù)提到，截至論文最終版本，年齡最大的F0代為30個月，最大的F1是12個月，F(xiàn)2代則還是新生豬。因此，研究團隊研究焦點主要放在F0代和F1代。

研究團隊首先要確定，致病基因有沒有讓這些基因敲入豬表現(xiàn)出和人一致的年齡相關的神經(jīng)學癥狀，并且這些癥狀是否遺傳給后代。

一般來說，亨廷頓病患者發(fā)病多在35歲到50歲，表現(xiàn)為舞蹈樣癥狀、認知和精神障礙。患者生命持續(xù)約10到20年，甚至有2-3年即去世的病例。令人惋惜的是，亨廷頓病發(fā)病時間一般已超過生育年齡，且為顯性遺傳，因此大多數(shù)患者都在發(fā)病前已“悄然”遺傳給下一代。

賴良學提到，“除非采用基因檢測，否則很難在沒有發(fā)病前意識到自己患病?！?/p>

研究結果顯示，基因敲入豬在4個月以前沒有表現(xiàn)出明顯癥狀，和同性別、同年齡野生型豬相比，體重增加也很少。

年齡較大的基因敲入豬皮膚則會有嚴重的褶皺和下垂。一些F0代基因敲入豬在5個月和10個月之間會過早死亡，也通常表現(xiàn)出走路畸形。這些癥狀都和人類相似。

賴良學介紹，“4個月以后，運動能力就開始受到一定的影響，正常走可能看不出來，但放到跑步機上，讓它使勁跑，它跑著跑著就不行，比正常的豬運動能力差?！闭撐闹刑岬?，用跑步機來觀察F0代豬的運動功能，結果顯示，一頭5個月大已經(jīng)表現(xiàn)出癥狀的基因敲入豬無法和正常對照組一樣運動，其他F0代豬也表現(xiàn)出類似的跑步困難。

值得一提的是，這頭5個月大的基因敲入豬在跑步機測試2天后即死亡了。研究團隊認為，這一點或許說明基因敲入豬難以承受運動負荷，呼吸衰竭可能是這頭豬死亡的直接原因。

而肺功能障礙和吸入性肺炎或窒息也可能是亨廷頓患者的主要死因。

另外，基因敲入豬表現(xiàn)出呼吸困難或者呼吸不規(guī)律。目前，呼吸困難只在基因敲入豬身上表現(xiàn)出來，此前在小鼠和其他動物模型上均未看到。

除癥狀之外，這些基因敲入豬的大腦區(qū)域選擇性神經(jīng)病理學也和人類相似。病理學分析顯示，5個月大基因敲入豬大腦尺寸比同齡的野生型豬要小，大腦皮層的厚度和紋狀體的尺寸也更小。對5個月大的已有癥狀的基因敲入豬進行MRI（核磁共振成像）分析也顯示出，它們的側腦室擴大、紋狀體尺寸則減小。

另外，163個臨床案例顯示，相比殼核，紋狀體的尾狀核會提前發(fā)生退化。而5個月大的有癥狀的基因敲入豬的紋狀體也表現(xiàn)出一致的退化順序。

代代相傳、多因素決定能活多久

值得一提的是，此前研究團隊用轉(zhuǎn)基因試圖建立的猴模型、豬模型，皆因表達外源性致病基因片段的毒性過強，出生不久后即死亡。而研究團隊此番成果的重要性之一就在于實現(xiàn)了傳代。

研究結果顯示，F(xiàn)1代在基因表達、體重增加、早期死亡、運動困難、呼吸困難等方面都和F0代類似。這意味著，發(fā)生在亨廷頓病患者身上的“遺傳性”在基因敲入豬模型上也同樣實現(xiàn)。

賴良學表示，“和人一樣，這些豬也可以發(fā)育到性成熟（豬性成熟在5-6個月），可以有后代。2010年我們發(fā)過的文章是用轉(zhuǎn)基因豬，它的癥狀就太明顯了，表達量太高，所以生下來幾天就死了。李曉江教授在美國用的轉(zhuǎn)基因猴也一樣，也沒活下去。沒活下來就沒有用，并沒有形成這個動物模型?！?/p>

不過有趣的是，基因型分析顯示，CAG重復并不穩(wěn)定。實驗結果得出，在F0代中是130-150 CAGs，F(xiàn)1代是113-206 CAGs，F(xiàn)2代是118-230 CAGs。另外，在不同組織中CAG重復也是不一致的。

賴良學認為，這或許是造成個體之間發(fā)病時間不一樣、發(fā)病輕重也不一樣的原因。

論文中還提到一個注意點，一頭含有206 CAGs的基因敲入豬比其它含有113-138 CAGs的幾頭豬壽命要長，這就暗示CAG重復長度并不是生命長短的唯一決定因素。

研究團隊指出，環(huán)境壓力以及其他因素同樣能影響這些豬最終能活多久。

研究也確實發(fā)現(xiàn)，對F1代的基因敲除豬采用“單間”飼養(yǎng)，也就是幫助它們減少環(huán)境壓力后，它們的壽命比F0代這些“群體”飼養(yǎng)的基因敲除豬要長。

值得一提的是，該項研究之所以被視為神經(jīng)退行性疾病研究領域中的一個里程碑式的發(fā)現(xiàn)，關鍵一點還在于此前經(jīng)常使用的模型為小鼠等嚙齒類動物，而種間差異實際上是一道很大的研究鴻溝。

論文中指出，盡管亨廷頓癥小鼠模型在突變亨廷頓蛋白方面表現(xiàn)出和年齡相關的累積，以及其他一些神經(jīng)學癥狀，但基因敲入亨廷頓小鼠缺乏明顯的神經(jīng)退行性，而這正是亨廷頓病經(jīng)典的病理學標記。

當然，和非人靈長類動物模型相比，豬和人類要遠一些。但豬模型的明顯優(yōu)勢在于，繁殖周期快（5-6個月即能性成熟）、一胎產(chǎn)仔量大（平均7-8頭小豬）。賴良學舉例表示，“以后也可以用類似的方法建立猴子模型，但通過猴子模型觀察和年齡相關的神經(jīng)退行性癥狀，以及利用它傳代再觀察后代，這將是一個很長的周期?！?/p>