癌癥組織中常見免疫細胞浸潤，其與腫瘤細胞、間質細胞等共同構成腫瘤微環(huán)境（TME）。三級淋巴結構（TLS）是免疫細胞在炎癥、感染或腫瘤組織中形成的有序異位區(qū)域結構。以往研究發(fā)現(xiàn)了構成腫瘤TLS的主要細胞種類，包括T細胞、B細胞、抗原呈遞細胞（APCs）、支持性的間質細胞和濾泡樹突狀細胞（FDC）。近期，利用單細胞和空間轉錄組學在卵巢癌、頭頸鱗癌、腎癌等研究進一步揭示了TLS中存在包括CXCL13+ T輔助細胞、SEMA4A+生發(fā)中心B細胞和CXCL12+成纖維細胞等關鍵細胞亞群。這些結果說明TLS組成復雜并存在廣泛的異質性。已有研究證實，TLS及其組分在抑制腫瘤進展和促進免疫治療反應中發(fā)揮重要作用，但TLS如何形成及其發(fā)揮作用機制尚未清楚。

2024年9月4日，廣東省精準醫(yī)學應用學會單細胞科技分會主任委員、中山大學腫瘤防治中心貝錦新教授及其團隊在《Nature Communications》發(fā)表了題為《Single-Cell and Spatial Transcriptome Analyses Reveal Tertiary Lymphoid Structures Linked to Tumour Progression and Immunotherapy Response in Nasopharyngeal Carcinoma》的研究論文。該研究以鼻咽癌（NPC）為模型，首次系統(tǒng)解析了單細胞和空間水平上腫瘤內TLS的細胞組成及抗腫瘤作用機制，為腫瘤患者免疫治療提供了新的靶點，為預測腫瘤免疫治療療效提供有效工具。

NPC腫瘤微環(huán)境以EB病毒（EBV）感染腫瘤細胞和大量免疫細胞的浸潤為主要特點。該團隊針對NPC不同分期、免疫檢查點抑制劑治療響應差異等臨床現(xiàn)象，利用10x Genomics 5' 單細胞轉錄組、免疫組庫（VDJ）測序以及Stereo-seq和Visium空間單細胞轉錄組測序等技術，解析NPC腫瘤組織內TLS的細胞組成，詳細刻畫了腫瘤進展、免疫治療響應相關的腫瘤TLS組成變化，解析了其抗腫瘤作用機制，并且通過細胞共培養(yǎng)實驗、生存分析、多重免疫組化和相關公共轉錄組數據集等方法驗證了重要的發(fā)現(xiàn)（圖1）。

圖1. 整體研究設計

研究人員首先利用單細胞轉錄組測序技術鑒定了NPC腫瘤組織中五個具有典型TLS標記物的細胞亞群，包括生發(fā)中心（GC）B細胞（CD19, MS4A1, RGS13, AICDA, BCL6；明區(qū)和暗區(qū)）、CD4+CXCR5+ T濾泡輔助細胞（CD4, CXCR5, CXCL13, BCL6）、CXCL13+CD8+ T細胞（CD8A, CXCR5, CXCL13, BCL6）以及CXCL13+腫瘤相關成纖維（CAFs）細胞（COL1A1, CXCL13, CCL19, CCL21），進一步利用Stereo-seq和Visium空間轉錄組測序技術驗證了上述細胞亞群空間位于TLS內。

針對TLS中GC B細胞的關鍵角色，研究人員通過擬時序分化軌跡分析揭示了幼稚B細胞向記憶B細胞、GC B細胞和漿細胞的分化過程。研究發(fā)現(xiàn)，生發(fā)中心反應所生成的漿細胞可能是抗腫瘤抗體的重要來源。然而，通過一系列生物信息學分析，研究人員觀察到，相較于早期NPC，在晚期NPC中GC B細胞與漿細胞之間的相同BCR克隆型轉換減少，漿細胞所產生的IgA和IgG抗體水平顯著較低；并且，低GC B細胞比例和抗體水平與患者不良預后相關。這些結果表明，隨著腫瘤進展，經歷生發(fā)中心反應的漿細胞抗體產生減少，進而不利于NPC患者的預后。進一步研究表明，NPC中的漿細胞與NK細胞和巨噬細胞緊密共定位，可能通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC；NK細胞）和抗體依賴性細胞吞噬（ADCP；巨噬細胞）作用促進腫瘤細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤效應。研究還發(fā)現(xiàn)，NPC內漿細胞的數量與高表達EBV相關分子的惡性細胞亞群（具有更強免疫抑制功能）呈負相關。通過定量分析空間轉錄組和多重免疫組化數據，研究人員發(fā)現(xiàn)漿細胞分泌的抗體通過ADCC和ADCP機制促進了高表達EBV相關分子惡性細胞的凋亡。這一過程對解除NPC的免疫抑制微環(huán)境以及改善NPC患者對免疫治療的響應具有重要意義。此外，研究還定義了腫瘤細胞聚集區(qū)域（TCA），根據其中EBV相關分子和漿細胞分布，能夠將NPC腫瘤分為四類，發(fā)現(xiàn)TCA表達高水平EBV相關分子和具有較多漿細胞浸潤的亞型（EBVhigh-TCA-wP）預后最好（圖2）。

該研究發(fā)現(xiàn)TLS相關CXCL13+CAFs通過CXCL13-CXCR5、VCAM1-整合素、ICAM1-整合素等配體-受體對與B細胞進行相互作用，并通過ST分析、多重免疫組化分析及體外細胞共培養(yǎng)實驗進一步證實了CXCL13+CAFs促進B細胞趨化、粘附以及分化和成熟。這些發(fā)現(xiàn)表明CXCL13+CAFs在促進NPC患者免疫應答和改善預后中扮演了重要角色。

研究者還發(fā)現(xiàn)TLS相關的CXCL13+CD8+ T細胞在識別和攻擊腫瘤細胞中可能發(fā)揮關鍵作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)CXCL13+CD8+ T細胞在早期腫瘤中的比例顯著高于晚期腫瘤，凸顯了它們在腫瘤早期階段發(fā)揮抗腫瘤潛力。這些發(fā)現(xiàn)表明在晚期腫瘤中增加CXCL13+CD8+ T細胞含量可能有助于提高抗腫瘤治療效果，為治療晚期腫瘤提了供新的策略。

最后，在NPC中與腫瘤TLS相關的細胞亞群通過配體-受體相互作用形成了一個免疫活化微環(huán)境，這與患者的預后密切相關。生存分析顯示，具有高TLS細胞標志（TLS-CS）的患者比低TLS-CS的患者呈現(xiàn)顯著更好的預后。此外，多重免疫組化染色驗證了含有TLS的樣本中免疫細胞浸潤程度更高，與患者更好的預后關聯(lián)，強調了TLS作為預后指標的獨立作用。這些研究結果表明，TLS中的關鍵細胞亞群不僅在NPC的腫瘤微環(huán)境中創(chuàng)建了一個免疫活化的區(qū)域，而且顯著影響患者的預后和對免疫治療的響應。這些發(fā)現(xiàn)再次強調了維持或增強這種免疫微環(huán)境的潛在治療價值。

總之，該研究首次利用高發(fā)于我國的EBV感染相關鼻咽癌，在單細胞和空間水平高分辨率上解析了腫瘤TLS細胞組成異質性，鑒定了構成TLS結構的重要細胞亞群及分子特征，闡明了TLS抑制腫瘤進展和促進免疫治療反應的機制（圖2），為基于TLS的腫瘤分子分型和免疫治療提供了新的策略。

圖2. 鼻咽癌免疫治療響應及非響應患者腫瘤組織細胞組分示意圖

中山大學腫瘤防治中心劉洋博士、何帥副研究員、遲冬梅主治醫(yī)生和王秀芝博士后、中山大學附屬第八醫(yī)院葉雙燕博士為本文的共同第一作者，中山大學腫瘤防治中心貝錦新教授為通訊作者。相關研究成果已申請專利，將進一步推動成果臨床轉化應用，保障人民健康。

該研究獲得國家自然科學基金與澳門科學技術發(fā)展基金（FDCT-NSFC；82261160657）、國家重點研發(fā)計劃（NKRDPC；2022YFC3400901）、國家自然科學基金（82130078）、廣州市科技計劃項目基金（201707020039）、廣東省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團隊計劃（2016ZT06S638）等資助。

貝錦新課題組主要從事精準醫(yī)學和轉化醫(yī)學研究，圍繞腫瘤精準醫(yī)學的核心理念，利用個體和單細胞水平的基因組、表達譜等多層次、多組學信息，挖掘與腫瘤發(fā)生發(fā)展及其異質性相關的分子、細胞及其作用網絡，研究候選分子、細胞調控腫瘤進展的重要機制，發(fā)現(xiàn)與腫瘤早期精準診斷相關的分子標志物，篩選針對腫瘤微環(huán)境演進關鍵事件的精準診治靶標，為實現(xiàn)腫瘤的個體化防診治提供有效解決方案。至今發(fā)表SCI論文100余篇，其中包括國際頂級專業(yè)雜志Cell、Lancet Oncology、Nature Genetics、Advanced Science、Genome Biology、Nature Communications等。團隊擁有高通量測序及基因分型、單細胞組學平臺（10X Genomics聯(lián)合實驗室）、高性能計算集群等平臺，所在依托單位擁有先進的動物、細胞、分子水平相關研究平臺。課題組經費充足、科研氛圍濃厚、團隊成員關系融洽。課題組長期招聘各類科研人員，歡迎對相關領域感興趣的博士后，博士生加入。

論文詳情請查閱：https://doi.org/10.1038/s41467-024-52153-4