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對于生物體系中自由基對及其量子特性的理解仍處于起步階段，這主要受限于高靈敏度儀器的缺乏，以及生化反應(yīng)的復(fù)雜性和磁場誘導(dǎo)自由基對反應(yīng)的微弱變化（低至或低于百分之一）。該研究團隊設(shè)計的新型光學(xué)系統(tǒng)能以高信噪比捕捉生物體系的量子力學(xué)特性。開發(fā)的磁熒光波動顯微光譜技術(shù)可檢測低至0.2%的熒光信號磁場效應(yīng)（接近單光子水平，采用單光子雪崩二極管），并在23種分子上驗證了該技術(shù)的有效性。該系統(tǒng)還配備了電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）相機作為輔助檢測模塊，通過新型數(shù)字鎖相放大技術(shù)實現(xiàn)相位敏感的磁場空間分布成像。上述功能在模型生物體系的自由基對光化學(xué)反應(yīng)中得到驗證。該儀器通過磁場效應(yīng)揭示了蛋白質(zhì)-黃素相互作用中光降解現(xiàn)象的重要性，這一發(fā)現(xiàn)將為探索生物環(huán)境中的類似量子效應(yīng)提供關(guān)鍵研究工具。

Luke P. Lee認為[1]：“Lewis Antill 和同事在 Nature Photonics 上撰文，開發(fā)了一種磁熒光波動顯微光譜（MFFMS）技術(shù)，該技術(shù)允許在接近單分子水平上監(jiān)測蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物中的量子相干效應(yīng)，有望在生物系統(tǒng)中應(yīng)用?！?/p>

圖1 MFFMS實驗原理圖

研究生物體系中的自由基對需要多種技術(shù)手段來揭示其復(fù)雜機制。該研究將熒光波動光譜(FFS)與磁場效應(yīng)(MFE)方法相結(jié)合，通過監(jiān)測黃素?zé)晒獾淖兓?，MFFMS技術(shù)可提供多種定量信息，包括距離測量、結(jié)合狀態(tài)、擴散系數(shù)、分子數(shù)量、自由基對動力學(xué)以及蛋白質(zhì)-配體和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等。

對比傳統(tǒng)技術(shù)局限，本研究的解決方法：

圖2 基于SPAD檢測的模型體系MFE研究

SPAD技術(shù)實現(xiàn)了模型體系中黃素蛋白復(fù)合物的超高靈敏度MFE檢測，首次在約7光子水平解析了自由基對的量子動力學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，黃素光降解產(chǎn)物（如缺失磷酸基的光黃素）會顯著影響蛋白-配體相互作用，其中溶菌酶（HEWL）與黃素單核苷酸（FMN）通過表面靜電作用形成非特異性結(jié)合，而牛血清白蛋白（BSA）與FMN則呈現(xiàn)特異性口袋結(jié)合，二者表現(xiàn)出截然不同的MFE響應(yīng)模式：HEWL-FMN體系隨流速變化顯示三重態(tài)自由基對主導(dǎo)的MFE變化，而BSA-FMN在高流速時出現(xiàn)單重態(tài)自由基對特征。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了蛋白結(jié)合特性與自由基對自旋態(tài)的構(gòu)效關(guān)系，更為在活細胞環(huán)境中研究生物量子效應(yīng)建立了高靈敏度的檢測新范式。

創(chuàng)新點圖示：

圖3 EMCCD檢測的MFE與數(shù)字鎖相（DLIA）分析

此外，創(chuàng)新性地開發(fā)了基于EMCCD- DLIA聯(lián)用的空間分辨磁場效應(yīng)檢測技術(shù)，通過0.25 Hz磁場調(diào)制和數(shù)字鎖相放大方法，成功實現(xiàn)了對HEWL-FMN自由基對200 ms響應(yīng)時間的精確測量（上升/衰減速率分別為4.76±0.98 s?1和5.08±0.95 s?1）。該技術(shù)將MFE檢測靈敏度提升至-1.37%（較原始數(shù)據(jù)提高2.3倍），并具備單次實驗處理16800幀圖像的高通量分析能力，有效克服了活細胞環(huán)境中的光漂白干擾。通過13階諧波重構(gòu)的FFT/IFFT（快速傅里葉變換/逆快速傅里葉變換）算法，首次實現(xiàn)了0.1%級弱信號的精準提取，為亞細胞尺度量子生物學(xué)研究提供了兼具空間分辨率和時間精度的創(chuàng)新工具。

創(chuàng)新點圖示：

圖4 BSA-FMN復(fù)合物的競爭性結(jié)合實驗與模擬分析

通過分子對接、競爭性結(jié)合實驗和分子動力學(xué)模擬，系統(tǒng)揭示了BSA蛋白中FMN通過特異性結(jié)合口袋2（與W211殘基形成≤4?關(guān)鍵間距）產(chǎn)生單重態(tài)自由基對的分子機制。實驗證實該結(jié)合可被萘普生（Kd=5.8×10-7 M）競爭性抑制，而MD模擬顯示FMN在口袋內(nèi)的動態(tài)擴散（3.5-6.5 ?）維持了自旋相干所需的電子間距，這為理解流速依賴性MFE變化提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，首次建立了蛋白質(zhì)結(jié)合微環(huán)境與自由基對量子行為的定量構(gòu)效關(guān)系。

創(chuàng)新點圖示：

本研究首次實現(xiàn)SPAD的MFE檢測，為單分子水平研究蛋白質(zhì)-配體的磁敏感光化學(xué)開辟了新途徑。DLIA分析進一步實現(xiàn)了熒光圖像中的MFE提取，通過剔除雜散信號，為定位細胞內(nèi)的磁敏感位點提供了有力工具。結(jié)合熒光強度、各向異性和MFE的多參數(shù)測量，可更全面揭示蛋白質(zhì)-配體動力學(xué)本質(zhì)。未來將通過安裝時間相關(guān)器，實現(xiàn)SC-AOTF（超連續(xù)光源-聲光可調(diào)濾光片組合）與SPAD聯(lián)用的皮秒時間分辨測量（如熒光壽命成像、時間分辨FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）及MFE）。增設(shè)第二個SPAD將支持熒光互相關(guān)光譜和FRET測量，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)，目前已在黃素和黃素蛋白的體外/體內(nèi)環(huán)境中展開應(yīng)用。

參考文獻：

[1] Lee L P. Single-photon quantum effects in biomolecules[J].Nature Photonics, 2025: 1-2.