當(dāng)?shù)貢r間3月2日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、中國疾控中心、加州大學(xué)洛杉磯分校、匹茲堡大學(xué)、湖南大學(xué)五家合作單位的研究人員共同在生物科學(xué)預(yù)印本網(wǎng)站bioRxiv在線發(fā)表了一項針對新冠病毒演化過程中的突變、重組和插入的重磅研究（“Mutations, Recombination and Insertion in the Evolution of 2019-nCoV”）。

研究通過分析病毒的突變，解釋新冠病毒為何傳染性能得到顯著增強(qiáng)。

團(tuán)隊還進(jìn)一步估計，大多數(shù)人類新冠病毒（2019-nCoV）和蝙蝠RaTG13病毒蛋白之間的差異發(fā)生在2005年至2012年之間，而人類SARS病毒和蝙蝠SARS樣冠狀病毒之間的差異發(fā)生在1990至2002年之間。

而除了點突變外，他們認(rèn)為還有潛在的證據(jù)表明重組也是2019-nCoV進(jìn)化的機(jī)制。他們的結(jié)果表明，2019-nCoV的S蛋白可能從穿山甲冠狀病毒衍生出來，而不是蝙蝠冠狀病毒RaTG13。而在2019- nCoV 的進(jìn)化過程中，RaTG13樣冠狀病毒和穿山甲樣冠狀病毒病毒株之間可能發(fā)生了重組。

該論文通訊作者為中國疾控中心病毒病預(yù)防控制所黨委書記武桂珍，中國疾控中心病毒病預(yù)防控制所研究員譚文杰，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)中心主任、蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所所長助理蔣太交，加州大學(xué)洛杉磯分校微生物與免疫遺傳學(xué)系教授程根宏。

研究團(tuán)隊收集并分析了120個2019-nCoV基因組序列，包括11個來自中國患者的新基因組。他們發(fā)現(xiàn)，盡管2019-nCoV、人和蝙蝠SARS-CoV（嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒）在整體基因組結(jié)構(gòu)中具有高度同源性，但它們通過受體結(jié)合域中（RBD）的潛在重組，演變成具有不同受體進(jìn)入特性的兩組病毒。

研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV在刺突蛋白（S蛋白）的S1和S2結(jié)構(gòu)域之間存在獨特的四個氨基酸插入(PRRA)，它可能是一個弗林（Fruin）或TMPRSS2（跨膜絲氨酸蛋白酶2）酶切位點。而此前的研究表明，冠狀病毒可能發(fā)生蛋白酶裂解，從而觸發(fā)病毒-細(xì)胞膜之間的融合。這種啟動和觸發(fā)融合機(jī)制的靈活性極大地調(diào)節(jié)了不同冠狀病毒的致病性和趨向性。

研究團(tuán)隊提出，RBD的潛在重組，以及獨特的弗林蛋白酶切位點的存在，可以解釋新冠病毒傳染性的顯著增加。

當(dāng)前，2019-nCoV在全球已經(jīng)導(dǎo)致超過77000人感染、2400人死亡（截至論文提交），其基因組在系統(tǒng)發(fā)育上與蝙蝠SARS病毒RaTG13株最相似，該病毒株于2013年在中國云南被首次分離。

研究人員表示，截至目前已經(jīng)有很多針對新冠病毒的研究，但導(dǎo)致這種病毒感染和分子進(jìn)化的機(jī)制仍不清楚，這項研究揭示了乙類冠狀病毒的進(jìn)化、特異性、以及增強(qiáng)感染力的可能機(jī)制，為2019-nCoV的進(jìn)化和傳播提供了全面的見解。

他們認(rèn)為，利用從不同地點、不同時間點的患者身上分離到的2019-nCoV毒株進(jìn)一步追蹤基因組突變，將為理解這種快速傳播病毒的分子進(jìn)化提供思路。

2019-nCoV傳播中發(fā)生的突變

研究團(tuán)隊將2019-nCoV的感染率與最近暴發(fā)的β冠狀病毒，即2002年的SARS病毒和2012年的MERS（中東呼吸綜合征）病毒的感染率進(jìn)行了比較。

與SARS和MERS相比，2019-nCoV的傳播速度要快得多。迄今為止，已確認(rèn)的2019-nCoV病例比2002年整個SARS暴發(fā)期間的病例要多。

在過去的18年中，科學(xué)家發(fā)表了很多冠狀病毒的基因序列，其中包括2002年SARS暴發(fā)期間從不同國家分離出的SARS病毒株，從沙特阿拉伯和阿拉伯聯(lián)合酋長國等中東國家也分離出很多MERS病毒株。

研究團(tuán)隊這次從包括武漢在內(nèi)的多個中國城市的新患者中收集并測序了11條全長2019-nCoV基因組序列。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，與人類SARS、MERS和其他冠狀病毒相比，這11個新的2019-nCoV病毒株與其他2019-nCoV病毒株類似，它們與蝙蝠冠狀病毒RaTG13病毒株同源性更高。

在氨基酸水平上，它們只在與人類和蝙蝠SARS中相應(yīng)氨基酸序列相同的一致序列位置上有少量隨機(jī)突變。

為了鑒定新的遺傳突變，研究人員使用新冠病毒株EPI_ISL_402125作為根，為GIAID（全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織）中的所有120個新冠病毒的可用完整基因組構(gòu)建了系統(tǒng)樹（更新至2020年2月18日）。

研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，根據(jù)核苷酸位置8517和27641，2019-nCoV病毒株可分為兩個主要類別。

120個2019-nCoV全長基因組的序列比對，包括11個新的基因組（以星號突出顯示），G1和G2分別用紅色和藍(lán)色標(biāo)記

第1組（G1）的所有病毒株在8517的位置有胸腺嘧啶，在27641位置有胞嘧啶，這與SARS中相應(yīng)的核苷酸表現(xiàn)相同；而第2組（G2）則相反，在8517有胞嘧啶，在27641則有胸腺嘧啶。

以上兩組病毒的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，最早的G1病毒株（EPI_ISL_406801）于2020年1月5日在武漢被收集，而最早的G2株則于2019年12月24日在武漢被分離得到。

上述兩組基因群在同一城市中的存在表明它們是共循環(huán)的，但是在疫情暴發(fā)早期它們的進(jìn)化是趨同的。在每個組中，研究人員還觀察到了多個病毒株的其他共有突變。

基于這些潛在的可遺傳突變以及識別時間和位置，研究人員生成了一個“突變樹”圖，以跟蹤單個共享突變并顯示不同分離株之間的關(guān)系。

例如，今年1月10日至1月15日在廣東省識別出的5個病毒株屬于上述第1組病毒，它們在核苷酸位置28578上均有相同的突變，這表明它們可能是由同一人傳播的。類似的病毒可能傳播給了1月29-1月31日在日本發(fā)現(xiàn)的3例病例，它們的病毒在2397核苷酸位置有額外突變，這一類似病毒可能也傳播給了1月22日在美國發(fā)現(xiàn)的1例病例，這例病例的病毒在10818核苷酸位置有一個額外突變。

研究團(tuán)隊還提到G10818T這個位置非常有趣，因為它在第1組和第2組中均由數(shù)個獨立的病毒株共享，這導(dǎo)致了orf1ab多蛋白內(nèi)的L3606F氨基酸突變。

G10818T在第1組和第2組中均由數(shù)個獨立的病毒株共享

目前尚不清楚第1組和第2組病毒株在10818位點的共同突變是否具有任何生長優(yōu)勢，但穿山甲和蝙蝠冠狀病毒在相同位置同樣有L3606V突變。

從樹狀圖來看，這兩組病毒株都已傳播到報告有2019-nCoV病例出現(xiàn)的大多數(shù)國家和地區(qū)，幾乎沒有例外，這表明這兩組病毒都是可以快速傳播的。

研究團(tuán)隊在討論環(huán)節(jié)提到，盡管這兩個不同的2019-nCoV組是在從動物傳播給人類之前或之后進(jìn)化尚待確定，這兩個群體都是首先在武漢被發(fā)現(xiàn)，然后傳播到中國的不同地區(qū)和多個國家。 

2019-nCoV與穿山甲冠狀病毒的比較

目前與新冠病毒最緊密相關(guān)的病毒株為β型冠狀病毒RaTG13，RaTG13此前從中華菊頭蝠中分離出。研究團(tuán)隊使用核苷酸序列對特定病毒蛋白（例如orf1a，S蛋白，基質(zhì)和核衣殼）進(jìn)行了其他系統(tǒng)發(fā)育分析后發(fā)現(xiàn)，RaTG13病毒株與其他蝙蝠類SARS樣冠狀病毒株同樣有密切關(guān)系。

研究人員進(jìn)一步估計，大多數(shù)2019-nCoV和RaTG13病毒蛋白之間的差異發(fā)生在2005年至2012年之間，而人類SARS病毒和蝙蝠SARS樣冠狀病毒之間的差異發(fā)生在1990至2002年之間。

研究人員在討論環(huán)節(jié)總結(jié)道到，“我們的進(jìn)化時鐘分析估計，2019-nCoV分別于大約12年前和30年前從RaTG13和人類SARS-CoV中分化出來。”而除了點突變外，還有潛在的證據(jù)表明重組也是2019-nCoV進(jìn)化的機(jī)制。

在比較全長S蛋白序列時，研究人員發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV與人和蝙蝠SARS病毒的序列同源性為39％，與MERS或其他冠狀病毒的同源性則為29％。

值得注意的是，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)2019-nCoV和穿山甲冠狀病毒在S蛋白的RBD（氨基酸315-550區(qū)域）中共享幾乎相同的氨基酸序列，但與RaTG13卻不相同。

穿山甲CoV（藍(lán)線）和RaTG13 / 2013（綠線）與2019-nCoV的氨基酸同源性對比圖，保守受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）以黃色突出顯示

為了證實這一發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊將此前別的課題組發(fā)表的穿山甲CoV與先前分離但未發(fā)表的穿山甲CoV序列進(jìn)行了比較。

基于比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，研究人員發(fā)現(xiàn)2019-nCoV的共有序列與BetaCoV / 穿山甲/廣東/P2S/2019（EPI_ISL_410544）具有最高的同一性，而在廣西分離的穿山甲CoV株則發(fā)現(xiàn)存在其他突變和插入缺失。

接下來，研究人員使用ML方法（Maximum likelihood，最大似然法）檢測了2019-nCoV的共有S蛋白序列與25種代表性CoV病毒株（包括Hu-CoV，SARS和MERS）和5新穿山甲CoV病毒株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

結(jié)果表明，2019-nCoV的S蛋白可能從穿山甲冠狀病毒衍生出來，而不是蝙蝠冠狀病毒RaTG13，當(dāng)然這兩者都可能與蝙蝠-SARS-CoV或bat-SL-CoVZC542處于同一譜系。

他們提出，2019-nCoV的整個基因組結(jié)構(gòu)與RaTG13最具有同源性，但S蛋白的RBD卻與穿山甲CoV最具同源性，這一差異表明在2019- nCoV 的進(jìn)化過程中，RaTG13樣冠狀病毒和穿山甲樣冠狀病毒病毒株之間可能發(fā)生了重組。

研究人員還進(jìn)一步檢查了基因組中的所有氨基酸突變。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)比較穿山甲樣冠狀病毒和2019-nCoV時，除了RBD外，nsp（非結(jié)構(gòu)蛋白）14和15中的區(qū)域還共享連續(xù)序列（圖3D）。

兩個進(jìn)化枝，以及獨特的弗林蛋白酶切位點

為了進(jìn)一步評估2019-nCoV與其他SARS冠狀病毒的關(guān)系，研究人員分析了2019-nCoV和不同的人/蝙蝠SARS病毒的RBM（Receptor binding motif，受體結(jié)合基序），并觀察到它們可以清楚地分為兩個不同的進(jìn)化枝。

進(jìn)化枝I病毒包括2019-nCoV、穿山甲CoV，以及12種蝙蝠SARS（蝙蝠SARS CoV I，例如RaTG13）和人類SARS病毒。

進(jìn)化枝II病毒則包含了49種蝙蝠SARS病毒（bat SARS CoV II），例如ZXC21和ZC45，它們與2019-nCoV有大約90％的核苷酸和氨基酸同源性性。

上述兩個進(jìn)化枝之間的主要區(qū)別在于，進(jìn)化枝II病毒的RBM存在5個、13-14個比進(jìn)化枝I病毒短的氨基酸區(qū)域。

此前的研究表明，SARS病毒RBM的13-14個氨基酸區(qū)域形成獨特的環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)通過兩個半胱氨酸殘基之間的二硫鍵穩(wěn)定。盡管該環(huán)區(qū)中2019-nCoV的氨基酸序列與人SARS病毒的氨基酸序列非常不同，但兩個半胱氨酸殘基都是保守的。

有趣的是，所有已知使用ACE2作為進(jìn)入受體的病毒都屬于I型，而所有不使用ACE2進(jìn)入受體的蝙蝠SARS病毒都屬于II型。因此，研究團(tuán)隊預(yù)測，包括2019-nCoV在內(nèi)的I型分支病毒可以通過人ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2）感染宿主細(xì)胞，而II型分支病毒不能通過ACE2感染宿主細(xì)胞。

此前的研究得出的是，SARS病毒使用人ACE2作為受體來感染宿主細(xì)胞，而MERS病毒則是使用DPP4作為其受體。最近的一些表明ACE2也是2019-nCoV的進(jìn)入受體，盡管其他宿主細(xì)胞因子如TMPRSS2也可能參與其中。

在進(jìn)化枝II病毒中，盡管它們的總體基因組序列與2019-nCoV存在同源性，但尚無屬于該枝的病毒利用ACE2進(jìn)入受體的報道。

因此，這一研究不僅強(qiáng)調(diào)了RBM在確定進(jìn)入受體特異性中的關(guān)鍵作用，而且提出了一個有趣的問題，即β冠狀病毒的同源病毒株如何通過RBM中的插入、缺失或重組等突變來改變趨向性。

值得注意的是，研究團(tuán)隊還發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV在S蛋白內(nèi)或核苷酸位置23619-23632上有獨特的四個氨基酸插入（681-PRRA-684）。

有趣的是，上述2019-nCoV的S蛋白中的這種插入（PRRA）為哺乳動物弗林蛋白酶蛋白創(chuàng)建了潛在的切割位點RRAR。

為了了解這種插入的獨特性，研究團(tuán)隊使用了來自人、麝貓和蝙蝠的SARS-CoV株進(jìn)行了序列比較。他們發(fā)現(xiàn)，這種插入是2019-nCoV特有的。當(dāng)與其他冠狀病毒家族成員進(jìn)行比較時，研究人員發(fā)現(xiàn)也能夠識別到類似的位于S蛋白的S1和S2域之間結(jié)構(gòu)邊界的插入。

而此前的研究則表明，病毒可能發(fā)生蛋白酶裂解，從而觸發(fā)病毒-細(xì)胞膜之間的融合。這種啟動和觸發(fā)融合機(jī)制的靈活性極大地調(diào)節(jié)了不同冠狀病毒的致病性和趨向性。

不過，此前在SARS-CoV中沒有檢測到這種蛋白酶裂解。在SARS-CoV中引入一個酶切位點，則會導(dǎo)致S蛋白的裂解并增強(qiáng)膜融合活性。此外，在SARS-CoV假型病毒中引入一個裂解的S蛋白，也會使其能夠直接進(jìn)入宿主細(xì)胞。

根據(jù)之前的測序和結(jié)構(gòu)分析，2019-nCoV S蛋白被預(yù)測為可以與ACE2受體相互作用，觸發(fā)與宿主細(xì)胞膜的融合并引發(fā)感染。因此，導(dǎo)致S1-S2亞基改變的突變或插入會顯著影響病毒感染。

研究團(tuán)隊推測，PRRA的插入可能使S蛋白裂解，從而觸發(fā)病毒融合事件。

雖然導(dǎo)致如此高感染率的確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，但研究團(tuán)隊認(rèn)為，他們的數(shù)據(jù)顯示RBD重組、S1和S2域插入獨特的弗林酶切點或TMPRSS2酶切位點，也許可以解釋為什么這個新出現(xiàn)的病毒和其他SARS、MERS相關(guān)的β冠狀病毒相比傳染性顯著增加。