原創(chuàng) 何笑松 返樸

丙肝是肝癌的一個(gè)主要致病因素。全球約有7100萬(wàn)人感染丙肝病毒，世衛(wèi)組織估計(jì)，2016年，約有39.9萬(wàn)人死于丙肝導(dǎo)致的肝硬化和肝細(xì)胞癌（原發(fā)性肝癌）。我國(guó)丙肝感染約有1000萬(wàn)例，中疾控?cái)?shù)據(jù)顯示，2019年新發(fā)病數(shù)有近22萬(wàn)。

好在，丙肝是可以治愈的。感謝科學(xué)家們幾十年堅(jiān)持不懈的努力，隨著抗丙肝病毒特效藥的問(wèn)世，徹底消除丙型肝炎這一惡疾的目標(biāo)已經(jīng)有望實(shí)現(xiàn)。

今年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主是發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒的三位病毒學(xué)家。其中，第一位發(fā)現(xiàn)丙型肝炎的科學(xué)家阿爾特，在苦苦尋覓丙肝病毒的途中，曾吶喊道：請(qǐng)“肝神”指一條明路吧！

Oh GREAT LIVER in the sky,

Show us where and tell us why

Send us thought that will inspire us

Let us see this elusive virus

——Harvey J. Alter，1988.

撰文 | 何笑松（加州大學(xué)戴維斯醫(yī)學(xué)院退休教授）

2020年10月5日，諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)宣布，病毒學(xué)家阿爾特（Harvey J. Alter）、霍頓（Michael Houghton）、萊斯（Charles M. Rice）三人共同獲得2020年的生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，獲獎(jiǎng)理由是“發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒”。這是繼1976年的乙型肝炎病毒諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)之后，為第二種肝炎病毒的發(fā)現(xiàn)所頒發(fā)的諾獎(jiǎng)。

病毒性肝炎是一大類常見(jiàn)病。感染肝臟、引起肝炎的病毒共有五型。這些病毒傳染的途徑和預(yù)后各不相同。五型肝炎中最常見(jiàn)的是甲、乙、丙三型，危害最大的則是乙型和丙型。甲型肝炎病毒通過(guò)糞-口途徑傳染，預(yù)后較好，絕大多數(shù)患者能自行清除病毒，完全康復(fù)，不會(huì)轉(zhuǎn)變成慢性感染。乙型和丙型病毒通過(guò)血液和身體的密切接觸傳染。成年人被乙型或丙型肝炎病毒感染后，相當(dāng)一部分患者（乙型約10%，丙型約70%）轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?，終身攜帶病毒。病毒攜帶者即使沒(méi)有臨床癥狀，仍可通過(guò)血液將病毒傳給他人。乙型和丙型肝炎病毒的慢性感染大大增加了發(fā)生肝硬化，乃至肝癌等終末期肝病的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者的健康和生命。

據(jù)世衛(wèi)組織（WHO）估計(jì)，全球共有大約7100萬(wàn)慢性丙肝患者，2016年一年死于由丙肝病毒造成的肝硬化或肝癌人數(shù)近40萬(wàn)[1]。中國(guó)的慢性丙肝患者人數(shù)約為1000萬(wàn)[1,2] 。乙肝病毒危害的人數(shù)更是數(shù)倍于丙肝病毒。

由此不難理解，為什么乙肝和丙肝病毒的發(fā)現(xiàn)者都贏得了諾獎(jiǎng)。雖然兩種病毒的發(fā)現(xiàn)前后相隔二十年，二者發(fā)現(xiàn)的經(jīng)過(guò)都充滿了戲劇性。本文講述關(guān)于丙肝病毒的故事，但這必須從乙肝病毒的發(fā)現(xiàn)說(shuō)起。

輸血后肝炎之謎

19世紀(jì)末到20世紀(jì)上半葉是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)快速發(fā)展的黃金時(shí)期，注射器的發(fā)明、藥物針劑以及輸血和血液制品的推廣使用，拯救了無(wú)數(shù)的生命。與此同時(shí)，醫(yī)學(xué)界也注意到這些治療措施有時(shí)會(huì)導(dǎo)致肝炎。病人接受輸血后發(fā)生肝炎，成為臨床上一個(gè)棘手的難題。據(jù)估計(jì)，20世紀(jì)中期，在美國(guó)接受輸血后發(fā)生肝炎的比例曾高達(dá)30%。由于對(duì)引起肝炎的病原體一無(wú)所知，也就無(wú)從鑒別哪些供血者和血液樣品帶有傳染性。為了防止發(fā)生輸血后肝炎，尋找肝炎病原體已經(jīng)成為刻不容緩的緊急任務(wù)。

就在此時(shí)，有兩位科學(xué)家正關(guān)注著一項(xiàng)與肝炎風(fēng)馬牛不相及的研究。1964年，美國(guó)遺傳學(xué)家布倫堡（Baruch Blumberg）與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）一名年輕的研究人員阿爾特（Harvey J. Alter）開(kāi)始合作，研究世界各地的不同人群中，由遺傳因素造成的血清中所含蛋白質(zhì)成分的差異。

他們發(fā)現(xiàn)，在一名澳大利亞土著居民的血液中，有一種獨(dú)特的蛋白質(zhì)，能被紐約市一名血友病患者的血清中所含的抗體識(shí)別。

血友病是一種遺傳病，病人血液中缺少某些凝血因子，使得凝血功能受損，微小損傷即可造成嚴(yán)重出血。這些病人需要經(jīng)常接受輸血，或輸入由血液制成的濃縮凝血因子來(lái)進(jìn)行治療。如果所接受的血液中含有病人自身的免疫系統(tǒng)從未接觸過(guò)的異源蛋白質(zhì)（抗原），病人就可能產(chǎn)生與之相應(yīng)的特異性抗體。布倫堡將他新發(fā)現(xiàn)的這種蛋白質(zhì)命名為“澳大利亞抗原”，簡(jiǎn)稱“澳抗”。那個(gè)血友病人血清中所含的特異性抗體可以用來(lái)探測(cè)其它血液樣品中是否存在澳抗。

美國(guó)的一般人群帶有澳抗的比例不高，布倫堡對(duì)澳抗這種蛋白質(zhì)的功能也一無(wú)所知。然而，兩個(gè)偶然遇到的病例，將布倫堡的研究引向了一個(gè)全新的方向。

布倫堡的實(shí)驗(yàn)室中有個(gè)女技術(shù)員，工作中經(jīng)常接觸含有澳抗的血清樣品。由于自己的血液中不含澳抗，因此她通常用自己的血清作為澳抗陰性的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。1967年的一天，她感覺(jué)不適，而且出現(xiàn)黃疸癥狀，被診斷為肝炎。當(dāng)她再次采集自己的血清來(lái)測(cè)定澳抗時(shí)，發(fā)現(xiàn)已從陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。另外一個(gè)病例是澳抗陰性的唐氏癥患者，在被研究期間得了肝炎，澳抗也由陰轉(zhuǎn)陽(yáng)。布倫堡于是恍然大悟，將澳抗與肝炎聯(lián)系起來(lái)。

與此同時(shí)，紐約血液中心有個(gè)叫普林斯（Alfred Prince）的研究人員，也利用來(lái)自一名接受過(guò)多次輸血治療的血友病人的血清抗體，在一批輸血后肝炎患者的血液中找到一種與肝炎密切相關(guān)的新抗原，隨后普林斯又發(fā)現(xiàn)，這種抗原就是已知的澳抗。

遺傳學(xué)家布倫堡無(wú)心插柳柳成蔭，一個(gè)華麗轉(zhuǎn)身成為公認(rèn)的肝炎病毒研究先驅(qū)， 并因此榮獲1976年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。獲獎(jiǎng)理由是“發(fā)現(xiàn)澳大利亞抗原，并且證明它與血清性肝炎（輸血后肝炎當(dāng)時(shí)的名稱）的聯(lián)系”（盡管有人認(rèn)為普林斯對(duì)證明這一聯(lián)系的貢獻(xiàn)比布倫堡更大）。

雖然此時(shí)澳抗的本質(zhì)仍屬未知——可能是導(dǎo)致肝炎的病原體（肝炎的原因），也可能是人體患肝炎后產(chǎn)生的反應(yīng)（肝炎的結(jié)果）——但阿爾特已經(jīng)敏銳地意識(shí)到，對(duì)供血者普遍進(jìn)行澳抗的篩選，將有助于防止輸血后肝炎。于是他開(kāi)始為此發(fā)聲呼吁[3]。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，澳抗就是乙型肝炎病毒的外殼蛋白質(zhì)，它被正式命名為“乙型肝炎表面抗原”。緊隨乙肝病毒之后，甲型肝炎病毒也被發(fā)現(xiàn)，相關(guān)的診斷試劑隨之被開(kāi)發(fā)出來(lái)，可以準(zhǔn)確方便地鑒別出被甲肝、乙肝病毒感染的病人。尤其重要的是，乙肝病毒攜帶者可以沒(méi)有任何肝炎臨床癥狀，他們的血液如果被用于輸血，就可能讓接受者染上乙肝。在阿爾特與其同事的大力推動(dòng)下，澳抗發(fā)現(xiàn)的短短幾年后，全美所有的血庫(kù)都對(duì)供血者實(shí)行了強(qiáng)制性的乙肝表面抗原篩選。

這一措施顯著降低了輸血后肝炎的發(fā)病率，但是并沒(méi)有像人們期待的那樣，杜絕輸血后肝炎的發(fā)生。 最初，這被歸咎于檢測(cè)方法不夠靈敏，血液中抗原濃度較低時(shí)可能漏檢；但在新的檢測(cè)方法大幅度提升靈敏度以后，輸血后肝炎依然存在。

到了1970年代末，乙肝表面抗原發(fā)現(xiàn)的十年之后，阿爾特等人終于確定，除了乙型肝炎之外，還存在其它類型的肝炎，可通過(guò)血液傳染。阿爾特籠統(tǒng)地稱之為非甲非乙型肝炎，因?yàn)檫€不了解它的病因是一種，還是多種病原體[4,5]。研究人員不得不重振旗鼓，投入新一輪的探索。

捉摸不定的丙肝病毒

有了發(fā)現(xiàn)兩種肝炎病毒（特別是乙肝病毒）的成功經(jīng)驗(yàn)在先，是不是就能駕輕就熟地找出非甲非乙型肝炎的病原體？

事實(shí)證明，沒(méi)這么簡(jiǎn)單。

乙肝病毒的發(fā)現(xiàn)過(guò)程中最關(guān)鍵的一項(xiàng)突破，莫過(guò)于確定澳抗與輸血后肝炎的聯(lián)系。確定這種聯(lián)系，依靠?jī)蓚€(gè)關(guān)鍵要素：已被發(fā)現(xiàn)的澳抗，和能夠方便準(zhǔn)確地探測(cè)到澳抗的抗體?？墒菍?duì)于非甲非乙型肝炎，研究人員對(duì)其抗原或抗體都一無(wú)所知，又該從何處著手？

盡管情況不容樂(lè)觀，有一項(xiàng)重要進(jìn)展還是帶來(lái)了希望。阿爾特與NIH的同事普賽爾（Robert Purcell），以及美國(guó)疾控中心（CDC）的布雷德利（Daniel Bradley）等幾個(gè)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，將非甲非乙型肝炎病人的血清注射到最接近人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物——黑猩猩——體內(nèi)，可以引發(fā)非甲非乙型肝炎，這表明黑猩猩可以作為非甲非乙型肝炎的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。再以陶瓷濾器將病人血清中可能含有的細(xì)菌濾除，過(guò)濾后的血清仍然能使黑猩猩致病，這表明病原體應(yīng)當(dāng)是一種（或幾種）比細(xì)菌小的病毒，而非細(xì)菌[6]。

阿爾特的首要目標(biāo)是防止輸血后肝炎的發(fā)生，為此必須找到一種方便靈敏的檢驗(yàn)方法，可以清楚地區(qū)分正常血液和致病血液?？墒撬膱F(tuán)隊(duì)用盡各種傳統(tǒng)方法，不管是直接探測(cè)病原體，還是間接探測(cè)人體對(duì)病原體的免疫反應(yīng)產(chǎn)物，都沒(méi)有成功。

在此過(guò)程中，阿爾特收集整理了一套血清樣品，其中有些來(lái)自感染了非甲非乙型肝炎的病人或黑猩猩，作為陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)樣品；另一些來(lái)自患有其它肝臟疾病的病人，作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣品有一個(gè)代碼，只有他本人掌握解碼的密鑰。新開(kāi)發(fā)的任何一種檢驗(yàn)方法都必須經(jīng)過(guò)這套標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)試，準(zhǔn)確地鑒別出其中所有的陽(yáng)性和陰性樣品，才能通過(guò)。

從1978年開(kāi)始，十年間，先后有多個(gè)研究非甲非乙型肝炎檢測(cè)試劑的團(tuán)隊(duì)，前仆后繼地向阿爾特的這套標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)起了共約20次挑戰(zhàn)，全都鎩羽而歸，無(wú)一例外。

1982年，出生于英國(guó)的病毒學(xué)家霍頓（Michael Houghton）移居美國(guó)，加入舊金山灣區(qū)新成立的凱榮（Chiron）公司，主持非甲非乙型肝炎病原體的研究。團(tuán)隊(duì)里有兩位骨干，華裔博士郭勁宏（George Kuo）和朱桂霖（Qui-Lim Choo）。八十年代初，正是以重組DNA為代表的分子生物學(xué)研究方興未艾之際，霍頓決定摒棄著眼于病毒的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的傳統(tǒng)策略，另辟蹊徑，采用基因克隆的方法，直接尋找病毒的遺傳物質(zhì)——核酸（DNA或者RNA）。

劃時(shí)代的重組DNA技術(shù)是在上世紀(jì)七十年代初期誕生的。美國(guó)斯坦福大學(xué)的伯格（Paul Berg）成功地把分別來(lái)自兩種不同病毒的兩個(gè)DNA片段準(zhǔn)確地拼接到一起，成為一個(gè)連續(xù)的重組DNA分子。一年后，伯格的同事科恩（Stanley Cohen）和加州大學(xué)的博耶（Herb Boyer）使用質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子，把伯格的結(jié)果向前又推進(jìn)一步。

質(zhì)粒是大腸桿菌中常見(jiàn)的一種環(huán)狀DNA分子，它獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，可以自主復(fù)制（參見(jiàn)《》）?？贫靼奄|(zhì)粒從細(xì)菌中分離出來(lái)，在特定的位置切開(kāi)，插入一段來(lái)自不同生物（可以是病毒，或者任何高等動(dòng)植物，乃至人類）的、帶有特定基因的DNA片段，再連結(jié)成環(huán)狀，然后將所得到的重組質(zhì)粒送回大腸桿菌細(xì)胞。隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，細(xì)胞中的重組質(zhì)粒也得到復(fù)制擴(kuò)增——這一過(guò)程就叫做基因克隆。質(zhì)粒就是用來(lái)克隆外源基因的載體。任何一種基因通過(guò)克隆之后，就可以很容易地在細(xì)菌中大量制造出來(lái)，供各種研究所用。除了質(zhì)粒，還有一種感染大腸桿菌的DNA病毒，叫做 λ 噬菌體，也可以作為克隆外源基因的載體。

基因克隆的第一步是取得帶有病毒的樣品——患非甲非乙型肝炎的病人或黑猩猩的肝臟或血漿，從中分離出核酸，將RNA轉(zhuǎn)化成DNA，與經(jīng)過(guò)切割的 λ 噬菌體載體混合，使之形成重組DNA分子。這樣得到的產(chǎn)物叫做基因文庫(kù)，其中包含大量的重組DNA分子，每個(gè)分子帶有一個(gè)外源基因的插入片段，絕大多數(shù)來(lái)自病人或者黑猩猩本身的基因組，一小部分可能來(lái)自肝炎病毒。

怎樣鑒別出那些專屬于病毒的基因呢？

霍頓首先嘗試分別構(gòu)建兩個(gè)基因文庫(kù)，一個(gè)使用肝炎患者的核酸，另一個(gè)使用健康個(gè)體的核酸，然后通過(guò)一些特殊手段，排除兩個(gè)基因文庫(kù)共有的基因，只留下肝炎基因文庫(kù)特有的基因。采用這樣的方法，他果然找到了一批只存在于肝炎基因文庫(kù)的外源基因片段?？墒沁M(jìn)一步的測(cè)試表明，這些都是在感染肝炎病毒后表達(dá)量增加的宿主基因產(chǎn)物，代表著宿主對(duì)病毒的反應(yīng)，而不是病毒本身的基因。這個(gè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)的思路是正確的，但或許是由于病毒基因的含量太低，所用方法的靈敏度不夠，所以失敗了?；纛D只能改弦更張，嘗試別的辦法。

為了提高病毒基因篩選的靈敏度和特異性，減少假陽(yáng)性結(jié)果，在郭勁宏的建議下，霍頓決定采用針對(duì)肝炎病毒蛋白質(zhì)的特異性抗體，但不是用它去直接探測(cè)臨床樣品中的病毒蛋白質(zhì)，而是間接篩選克隆到噬菌體載體上的病毒基因在細(xì)菌里合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。

但是，這樣的抗體從何而來(lái)？唯一可能的來(lái)源就是非甲非乙型肝炎病人的血清。

然而，這些血清中究竟有沒(méi)有霍頓想要的抗體，如果有的話，含量是不是足夠，誰(shuí)也不知道。以乙肝為例，病人血液中有大量的病毒表面抗原，但是卻沒(méi)有針對(duì)表面抗原的抗體。只有到了肝炎痊愈，病毒被清除后，這樣的抗體才會(huì)出現(xiàn)?？墒钱?dāng)時(shí)卻還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)罹患非甲非乙型肝炎后自行恢復(fù)的病例。

搜尋未知病毒就像是在大海里捕撈一種從來(lái)沒(méi)有人釣到過(guò)的魚(yú)。假定在一片海域可能有這種魚(yú)出沒(méi)，但此魚(yú)的口味十分刁鉆，只咬一種從來(lái)沒(méi)人用過(guò)、其它魚(yú)類一概不吃的魚(yú)餌。漁夫不知道這個(gè)魚(yú)餌是什么，于是就準(zhǔn)備了一大批魚(yú)鉤和他所能找到的所有的不同食材，每只魚(yú)鉤掛上一塊，全都扔進(jìn)海里，然后坐等魚(yú)兒上鉤。

采用這樣的策略釣魚(yú)能有幾分勝算，這是所有人的疑問(wèn)。但漁夫霍頓還是拿定主意，揚(yáng)帆出海。為了盡可能提高基因文庫(kù)中病毒基因的含量，霍頓決定選用一份感染能力最強(qiáng)的非甲非乙型肝炎血液樣品來(lái)制備基因文庫(kù)。要做到這一點(diǎn)，多虧了肝炎的黑猩猩模型——將每個(gè)待測(cè)的病人或者黑猩猩血樣逐級(jí)稀釋，分別接種到黑猩猩體內(nèi)，觀察發(fā)病情況，即可找到仍然保持感染能力的最高稀釋度。稀釋度越高，表示這份血液中所含的病毒越多。霍頓向CDC的布雷德利要到了一份患病黑猩猩的血漿，其感染能力達(dá)到已知的最高水平。他親自動(dòng)手，把樣品放入離心機(jī)高速旋轉(zhuǎn)，使血漿中所含的病毒顆粒沉淀，分離出核酸，制成基因文庫(kù)，交給朱桂霖。

朱桂霖將基因文庫(kù)按一定比例與大腸桿菌混合，使其中的一小部分細(xì)菌被重組噬菌體感染，然后將細(xì)菌平鋪在瓊脂培養(yǎng)基上。未受感染的細(xì)菌在瓊脂表面正常生長(zhǎng)，連成一片，像草坪一樣。進(jìn)入細(xì)胞的噬菌體則開(kāi)始繁殖復(fù)制，同時(shí)按照所攜帶的外源基因片段合成外源蛋白質(zhì)。噬菌體復(fù)制到一定程度后，細(xì)菌細(xì)胞被殺死破裂，釋放出新產(chǎn)生的噬菌體，再感染周?chē)募?xì)菌，開(kāi)始新一輪的噬菌體DNA復(fù)制和外源基因表達(dá)。如此反復(fù)循環(huán)，最后在長(zhǎng)滿瓊脂表面的不透明的細(xì)菌草坪中出現(xiàn)許多透明的斑點(diǎn)，叫做噬菌斑，每個(gè)噬菌斑都是因同一個(gè)原始重組噬菌體的感染而被殺死的細(xì)菌，其中含有擴(kuò)增后的噬菌體，以及噬菌體所帶外源基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。只要基因文庫(kù)與細(xì)菌的比例合適，一片直徑15厘米的圓形瓊脂培養(yǎng)基表面可以有幾千個(gè)噬菌斑，彼此互不相連。

培養(yǎng)基中的白色細(xì)菌草坪上的透明圓斑即是病毒制造的噬菌斑丨來(lái)源：wikipedia

下一步就是用針對(duì)非甲非乙型肝炎病毒蛋白質(zhì)的抗體，去釣出那些含有病毒蛋白質(zhì)的噬菌斑，找到病毒基因?；纛D只能寄希望于他用來(lái)當(dāng)魚(yú)餌的肝炎病人血清，希望其中恰好含有這樣的抗體。他制作的第一個(gè)基因文庫(kù)經(jīng)篩選后，沒(méi)有得到任何病毒基因。于是他另起爐灶，用同一份黑猩猩血液重新制作一個(gè)基因文庫(kù)。這一次在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不幸發(fā)生技術(shù)故障，所得到的核酸樣品外觀不很正常。他猶豫再三，最后決定還是繼續(xù)進(jìn)行下去，完成了基因文庫(kù)的制作，交給同事篩選。

同時(shí)，霍頓決定改變抗體的來(lái)源，換用一個(gè)肝臟炎癥特別嚴(yán)重的肝炎病人的血清，理由是癥狀嚴(yán)重可能是因?yàn)椴《緩?fù)制特別活躍，患者的免疫反應(yīng)特別強(qiáng)烈，血清中的抗病毒抗體含量也許就特別高。

這一次篩選，總共得到六個(gè)陽(yáng)性的噬菌斑，從中分離出六個(gè)重組噬菌體。其中是不是帶有病毒基因？由于早先的技術(shù)故障，所有人都不抱多少希望。后續(xù)的測(cè)試不出所料地將這六個(gè)克隆的基因一個(gè)接一個(gè)地排除……輪到最后一個(gè)克隆基因了，實(shí)驗(yàn)記錄本上的編號(hào)是5-1-1，竟然并非來(lái)源于黑猩猩宿主的基因組，而是一個(gè)前所未知的基因，極有可能就是新病毒！

隨后的6個(gè)月里進(jìn)行的一系列測(cè)試終于沒(méi)有令人失望。5-1-1號(hào)克隆的確來(lái)自一種新病毒的RNA，但只是它的一小段。這一點(diǎn)難不倒研究人員。他們很快就以這個(gè)小片段作為把手，從基因文庫(kù)中把與它重疊的新病毒RNA片段逐一找到，拼接成完整的病毒RNA，發(fā)現(xiàn)5-1-1號(hào)克隆只占它的1.5%?；纛D將新病毒正式命名為丙型肝炎病毒[7]。

值得一提的是，得到5-1-1號(hào)克隆以后，霍頓又用同一份黑猩猩血液制作了幾個(gè)基因文庫(kù)，卻再也沒(méi)有直接篩選到來(lái)自同一病毒的第二個(gè)克隆，充分說(shuō)明了這條技術(shù)路線的困難程度。在不得已的情況下采取一個(gè)近乎賭博的全新策略，居然能如愿以償?shù)卣业轿粗男虏《?，不能說(shuō)不包含幾分運(yùn)氣的成分。可是機(jī)遇只會(huì)眷顧永不放棄的追求者。霍頓成功的背后是整個(gè)團(tuán)隊(duì)連續(xù)六年堅(jiān)持不懈的努力，數(shù)不清的失敗，以及累計(jì)篩選數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的重組噬菌體的巨大工作量。

霍頓的工作之所以意義重大，不僅在于他發(fā)現(xiàn)了一個(gè)臨床醫(yī)學(xué)上十分重要的新病毒，還在于他開(kāi)創(chuàng)了一條搜尋未知病原體的全新途徑，啟迪了其他新的病原體的發(fā)現(xiàn)，堪稱居功至偉。

霍頓團(tuán)隊(duì)通過(guò)這條途徑發(fā)現(xiàn)丙肝病毒的過(guò)程之所以如此曲折艱難，主要的障礙就是丙肝病毒的遺傳物質(zhì)及其基因產(chǎn)物在血液中的含量比其它一些病毒，例如乙肝病毒，低得多。要到以PCR為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增技術(shù)開(kāi)發(fā)完善并普遍應(yīng)用之后，這個(gè)障礙才被逐步克服。新一代核酸測(cè)序技術(shù)以及生物信息學(xué)的發(fā)展，更大大加快了病原體的發(fā)現(xiàn)和鑒定過(guò)程。時(shí)至今日，對(duì)于一種未知的新發(fā)病原體，例如新冠病毒，從采集樣品到測(cè)定病毒基因序列并確定其為新型病毒，很可能只需要短短幾天[8]。三十年來(lái)分子生物學(xué)飛速發(fā)展，帶來(lái)的變化何止天翻地覆！

發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒以后，霍頓團(tuán)隊(duì)當(dāng)即利用基因工程的方法，將病毒基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌和酵母菌中，制造出病毒蛋白質(zhì)，作為抗原，來(lái)檢測(cè)血液中是否存在針對(duì)它們的抗體。他們發(fā)現(xiàn)，這樣的抗體只存在于患有丙型肝炎（即非甲非乙型肝炎）的黑猩猩血清中，而不在患有甲型或乙型肝炎的黑猩猩血中。這表明，這樣制造出來(lái)的病毒蛋白質(zhì)可以作為丙型肝炎的診斷試劑！于是，霍頓向阿爾特索取了他的那套標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，用來(lái)進(jìn)行最后的評(píng)判。所有的非甲非乙型肝炎樣品都測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)一漏網(wǎng)；所有的對(duì)照樣品都測(cè)出陰性結(jié)果，明白無(wú)誤。試驗(yàn)圓滿成功，阿爾特夢(mèng)寐以求的丙型肝炎診斷試劑終于誕生了[9]。

1990年，凱榮公司的丙型肝炎診斷試劑被FDA正式批準(zhǔn)，并用于為美國(guó)所有的血庫(kù)篩選供血者。到了1992年，美國(guó)輸血后肝炎的發(fā)病率降到了1.5%。此后，丙型肝炎診斷試劑又得到改進(jìn)，檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高。從1992年到1997年，阿爾特跟蹤研究了650例接受輸血的病人，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一例輸血后肝炎，發(fā)病率降到了0.15%以下，與1970年相比，降幅高達(dá)200倍。

為什么發(fā)病率沒(méi)有完全降到零？一般認(rèn)為，這并不是由于血液中還存在未知的肝炎病毒，而是因?yàn)楦窝撞《靖腥救梭w后，要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間才能產(chǎn)生抗體，而在這段空窗期內(nèi)，血液里的病毒已經(jīng)能夠傳染肝炎。采用以PCR為基礎(chǔ)的高靈敏度核酸擴(kuò)增方法來(lái)直接探測(cè)丙肝病毒RNA，就可以解決這個(gè)殘留的輸血安全問(wèn)題。

阿爾特和霍頓對(duì)防止輸血后肝炎和發(fā)現(xiàn)丙肝病毒做出了杰出的貢獻(xiàn)，2000年，二人榮獲被視為諾獎(jiǎng)風(fēng)向標(biāo)的拉斯克臨床醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

藥物開(kāi)發(fā)之爭(zhēng)

1957年，英國(guó)病毒學(xué)家艾薩克斯（Alick Isaacs）和林登曼（Jean Lindenmann）正在研究流感病毒。當(dāng)時(shí)已知流感病毒能感染體外培養(yǎng)的雞胚胎細(xì)胞，把細(xì)胞殺死。不過(guò)二人發(fā)現(xiàn)，如果先用加熱滅活的流感病毒處理細(xì)胞，細(xì)胞就能對(duì)流感病毒產(chǎn)生抵抗力，之后再遇到活病毒，也不會(huì)被感染。他們推測(cè)，雞胚細(xì)胞接觸到死的流感病毒以后能產(chǎn)生某種物質(zhì)，抑制流感病毒的生長(zhǎng)。他們把這種物質(zhì)命名為“干擾素”。

保護(hù)我們身體的免疫大軍中有一支前哨部隊(duì)，稱為天然免疫系統(tǒng)，它是人體與生俱來(lái)的保護(hù)機(jī)制，構(gòu)成對(duì)抗病原體感染的第一道防線。這支前哨部隊(duì)的一個(gè)主要武器，是由人體細(xì)胞產(chǎn)生的具有不同免疫功能的一些小分子蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為細(xì)胞因子。干擾素就是一類重要的細(xì)胞因子。繼艾薩克斯和林登曼之后，其他研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)干擾素有許多重要的功能，例如直接抑制病毒的復(fù)制繁殖。而且干擾素的抗病毒作用沒(méi)有專一性，并非只針對(duì)流感病毒，而是對(duì)許多病毒都有效。

早在丙肝病毒發(fā)現(xiàn)之前的1986年，就有人嘗試用干擾素治療非甲非乙型肝炎，并且取得了不錯(cuò)的效果。1991年，干擾素被正式批準(zhǔn)用于治療丙肝。以干擾素配合一種小分子抗病毒藥利巴韋林（ribavirin），用于丙型肝炎，可以在大約一半的病人中實(shí)現(xiàn)清除病毒，徹底治愈的理想效果。由此，丙肝成為干擾素在臨床應(yīng)用中最主要的適應(yīng)癥。

遺憾的是，干擾素療法的副作用極為嚴(yán)重。接受治療的病人會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、疲倦、肌肉酸痛等等一系列癥狀，類似得了流感。這是因?yàn)槿梭w被流感病毒感染后，天然免疫系統(tǒng)受病毒刺激，產(chǎn)生干擾素來(lái)對(duì)抗感染。流感的臨床癥狀，在很大程度上屬于體內(nèi)產(chǎn)生的干擾素及其它細(xì)胞因子的副作用。除此之外，干擾素還可能引起嚴(yán)重的抑郁癥。許多病人由于不能忍受這些副作用，無(wú)法完成24周到48周的正常療程，被迫降低劑量或者中斷治療，嚴(yán)重影響了療效。

治療丙肝的高效低毒的理想藥物，直到2010年才出現(xiàn)。這一里程碑式的重大進(jìn)展，可以追溯到丙肝病毒發(fā)現(xiàn)伊始的1990年代。其中的兩位關(guān)鍵人物，在他們開(kāi)始進(jìn)行研究時(shí)，未必預(yù)見(jiàn)到自己的工作日后會(huì)有如此深遠(yuǎn)的影響。

盡管霍頓得到的丙肝病毒基因克隆為開(kāi)發(fā)丙肝檢測(cè)試劑鋪平了道路，但要證明這一新病毒的確是非甲非乙型肝炎的病原體, 還缺少最后一個(gè)關(guān)鍵證據(jù)，那就是將克隆的病毒基因組接種到黑猩猩中，能引起非甲非乙型肝炎。

除此之外，為了研究丙肝病毒的生物學(xué)性狀，尤其是在肝細(xì)胞中復(fù)制生長(zhǎng)的特性，就必須讓病毒在實(shí)驗(yàn)室里培養(yǎng)的細(xì)胞中生長(zhǎng)。丙肝病毒基因組被克隆以后，就有人將它輸入體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然克隆的病毒基因組可以指導(dǎo)合成病毒的各種蛋白質(zhì)，卻不能產(chǎn)生新的病毒顆粒。原因何在？

1996年，美國(guó)圣路易斯華盛頓大學(xué)的病毒學(xué)家萊斯（Charles Rice）發(fā)現(xiàn)，丙肝病毒RNA分子的末端有個(gè)特別的結(jié)構(gòu)，在被克隆的丙肝病毒基因組中丟失了。會(huì)不會(huì)就是這個(gè)缺失的結(jié)構(gòu)影響了病毒的生長(zhǎng)復(fù)制？

萊斯構(gòu)建了新的丙肝病毒基因組克隆，將RNA分子末端的這個(gè)結(jié)構(gòu)添補(bǔ)回去，然后滿懷希望地把這個(gè)“完整”的病毒RNA注射到黑猩猩肝臟內(nèi)。黑猩猩還是沒(méi)有得上肝炎，哪怕表現(xiàn)出任何遭到感染的跡象。實(shí)驗(yàn)失敗了。

不為挫折所阻，萊斯繼續(xù)探索。他進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，克隆得到的丙肝病毒基因組中有一些突變。他推測(cè)，這些突變可能在被克隆之前就已存在于宿主內(nèi)，也可能是在被人工克隆的過(guò)程中發(fā)生的。不論是哪一種情況，突變可能影響了病毒RNA的復(fù)制能力。那么怎樣才能把這些突變恢復(fù)到突變發(fā)生前的核苷酸呢？

突變發(fā)生的位點(diǎn)是隨機(jī)的，不同的RNA分子可能在不同的位點(diǎn)存在突變。萊斯分析比較了一大批克隆得到的病毒RNA分子，找到每一個(gè)存在變異的位點(diǎn)，在這個(gè)位點(diǎn)上選用最普遍的公用核苷酸來(lái)嘗試修正突變?cè)斐傻淖儺?。用這樣的方法，萊斯構(gòu)建出丙肝病毒的一個(gè)“共有基因序列”，把它注射到黑猩猩體內(nèi)，果然引起了肝炎！這表明，他已經(jīng)得到了一個(gè)具有感染能力的丙肝病毒基因組[10]。這一重要突破不僅坐實(shí)了丙肝病毒就是非甲非乙型肝炎的病原體，而且為丙肝病毒的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

2001年，萊斯離開(kāi)華盛頓大學(xué)，加盟紐約的洛克菲勒大學(xué)。洛克菲勒大學(xué)是美國(guó)歷史悠久的病毒學(xué)研究搖籃，曾經(jīng)孕育了包括流感病毒、黃熱病毒、脊灰病毒等一系列重要病原體的許多重大發(fā)現(xiàn)。萊斯的到來(lái)又使之成為丙肝病毒的研究重鎮(zhèn)，取得一系列開(kāi)創(chuàng)性的成果。

大約與萊斯同時(shí)，德國(guó)美茵茨大學(xué)的病毒學(xué)家巴騰許拉格（Ralf Bartenschlager）也構(gòu)建了一個(gè)丙肝病毒的共有基因序列。他想讓這個(gè)病毒基因組在體外培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞中復(fù)制生長(zhǎng)，卻失敗了。改用萊斯的克隆以后，還是沒(méi)有成功。

巴騰許拉格后來(lái)轉(zhuǎn)到德國(guó)最古老的海德堡大學(xué)任教，在風(fēng)光旖旎的內(nèi)卡河畔繼續(xù)探索這個(gè)難題。他聯(lián)想到與丙肝病毒有親緣關(guān)系的其它一些病毒，基因組中即使丟失了某些基因，病毒RNA還能在細(xì)胞中復(fù)制。如果去掉丙肝病毒基因組中那些與RNA復(fù)制無(wú)直接關(guān)系的部分，例如編碼病毒外殼蛋白質(zhì)的那些基因，只留下RNA復(fù)制所必須的部分，讓病毒丟掉包袱，輕裝上路，是不是就能提高病毒RNA在培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制效率？像這樣精簡(jiǎn)而成的人造病毒結(jié)構(gòu)叫做“復(fù)制子”。這一次，試驗(yàn)終于成功了[11]！

隨后，巴騰許拉格與萊斯對(duì)復(fù)制子系統(tǒng)的病毒RNA以及細(xì)胞株進(jìn)行了一系列改進(jìn)，終于得到了可以在培養(yǎng)細(xì)胞中高效復(fù)制的丙肝病毒RNA。雖然復(fù)制子不帶病毒的外殼蛋白質(zhì)基因，不能包裝出完整的病毒顆粒，但可以用來(lái)研究丙肝病毒RNA復(fù)制的生物學(xué)機(jī)制。更重要的是，它有可能用來(lái)在體外高效快速地篩選抑制丙肝病毒復(fù)制的化合物分子，作為治療丙肝的候選藥物。

在此之前，有效的小分子抗病毒藥物寥寥無(wú)幾。由美國(guó)政府資助的生物醫(yī)學(xué)類研究課題中，有關(guān)艾滋病的研究在資助金額上多年獨(dú)占鰲頭，取得的成果是由幾種抗HIV藥物聯(lián)合組成的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法 (HAART)，即所謂的“雞尾酒療法”。 它可以有效地延長(zhǎng)患者生命，卻無(wú)法將病毒徹底清除，充分說(shuō)明了開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的艱難程度（參閱《》）。盡管如此，在丙肝病毒復(fù)制子系統(tǒng)問(wèn)世以后，還是有一批研究人員投入了海選抗丙肝化學(xué)藥物的比拼，競(jìng)爭(zhēng)極為激烈。

丙肝病毒RNA的復(fù)制依靠的是蛋白質(zhì)NS5B，即病毒本身的RNA聚合酶。復(fù)制所用的原料分子是核苷酸，根據(jù)病毒的單鏈RNA分子的核苷酸序列，RNA聚合酶將原料核苷酸一一連結(jié)起來(lái)，形成新的病毒RNA。丙肝病毒有許多不同的基因型，彼此之間差異很大，但是這些不同基因型的RNA聚合酶則十分相似，這意味著，只要找到一種能抑制RNA聚合酶活性的藥物，就可能對(duì)各種基因型的病毒都有效，起到事半功倍的效果。

美國(guó)新澤西州有一家研制抗病毒藥物的小公司，叫做法莫賽特（Pharmasset），利用丙肝復(fù)制子系統(tǒng)找到一些化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于核苷酸的小分子化合物。這些核苷酸類似物能被丙肝病毒的RNA聚合酶誤認(rèn)為是制造RNA的核苷酸原料，添加到新合成的RNA鏈上；可是這些偽裝的原料分子一旦進(jìn)入位置，下一個(gè)核苷酸就再也連接不上，病毒RNA的延長(zhǎng)就此終止?？磥?lái)這些核苷酸類似物有希望成為抑制丙肝病毒RNA復(fù)制的藥物。可是，這些化合物到了動(dòng)物體內(nèi)后，就都出了問(wèn)題，有些很快就降解失效，有些難以進(jìn)入肝細(xì)胞，研究就此停滯不前。

2005年，法莫賽特公司延聘剛離開(kāi)一家大藥廠的化學(xué)家索非亞（Michael Sofia），負(fù)責(zé)抗丙肝病毒藥物的研制，希望他能將這一項(xiàng)目帶出困境。索非亞與他的團(tuán)隊(duì)成員殫精竭慮，嘗試對(duì)那些核苷酸類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種各樣的修改。他們發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入細(xì)胞的核苷酸類似物本身的抗病毒能力并不強(qiáng)，可是經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)所含一系列代謝酶的作用，能夠轉(zhuǎn)化成為具有高活性的分子結(jié)構(gòu)，有效抑制病毒RNA的復(fù)制。但原有的核苷酸類似物接受這種轉(zhuǎn)化的效率很低，必須改用另一種結(jié)構(gòu)略有不同的前體?？墒悄欠N前體分子又帶有負(fù)電荷，無(wú)法穿過(guò)肝細(xì)胞表面的細(xì)胞膜。為了使它能穿膜進(jìn)入肝細(xì)胞，又必須設(shè)法作進(jìn)一步的修飾，將負(fù)電荷屏蔽起來(lái)……就這樣，每一個(gè)問(wèn)題的解決，總是伴隨著新問(wèn)題的產(chǎn)生。成功的希望，一次又一次地被打碎，最后目標(biāo)似乎總是可望而不可及。

索非亞早年在康奈爾大學(xué)求學(xué)，曾以本科生的身份到一個(gè)化學(xué)教授的實(shí)驗(yàn)室當(dāng)助手。他開(kāi)始做第一個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，有個(gè)研究生學(xué)長(zhǎng)將他拉到一旁，鄭重其事地告誡：“你得明白，來(lái)做研究，你的努力只有百分之二十能成功，百分之八十全是失敗。所以你得滿足于百分之二十的成功率。要不然，就趁早別干?！?多年以后，索非亞談到研制丙肝藥物的個(gè)中艱辛?xí)r，回憶起那位師兄，說(shuō)道：“現(xiàn)在我終于曉得，他可真是個(gè)樂(lè)天派??！”

經(jīng)歷了無(wú)數(shù)次的失敗，索非亞與他的團(tuán)隊(duì)終于成功設(shè)計(jì)出一個(gè)不帶電荷的藥物分子，可以順利地進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)由肝細(xì)胞內(nèi)特有的一種代謝酶的作用，脫去屏蔽，暴露出負(fù)電荷，成為活性物質(zhì)的前體。由于帶有負(fù)電荷，這些前體分子無(wú)法再穿過(guò)細(xì)胞膜離開(kāi)肝細(xì)胞，只能在肝細(xì)胞內(nèi)逐步轉(zhuǎn)變成抑制病毒RNA復(fù)制的活性結(jié)構(gòu)。同時(shí)，人體內(nèi)的其它細(xì)胞不含有那種特殊的酶，不會(huì)留存藥物分子，這就大大降低了藥物對(duì)人體的毒副作用。所有研究人員孜孜以求的口服高效低毒抗丙肝藥物終于誕生了，起名為索非布韋（sofosbuvir）[12]。當(dāng)索非亞在一個(gè)專業(yè)會(huì)議上首次披露這一成果時(shí)，全場(chǎng)鴉雀無(wú)聲。盯著屏幕上顯示的數(shù)據(jù)，另一家公司的一個(gè)與會(huì)者喃喃地自言自語(yǔ)：“比賽結(jié)束了……”

2012年，美國(guó)研制抗病毒藥物的龍頭老大吉利德（Gilead）公司以112億美元的高價(jià)收購(gòu)了法莫賽特。2013年，美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)索非布韋用于治療慢性丙型肝炎，吉利德公司隨即將它推向市場(chǎng)。除了索非布韋，還有另一種藥物雷迪帕韋（ledipasvir）同樣是經(jīng)由復(fù)制子系統(tǒng)篩選得到，但針對(duì)的靶標(biāo)是丙肝病毒的另一種蛋白質(zhì)NS5A。這兩種藥物聯(lián)用，只需經(jīng)過(guò)8至12周的治療，94%至99%的病人都能清除病毒，徹底痊愈，而且副作用極低。

丙肝治療特效藥的誕生過(guò)程充分說(shuō)明，成功的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)離不開(kāi)堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)研究。研制抗丙肝病毒藥的巨大成功，為人類消除丙型肝炎帶來(lái)了曙光。2016年，世衛(wèi)組織（WHO）制定了預(yù)防和治療雙管齊下，到2030年在全球基本控制乙型肝炎和丙型肝炎的規(guī)劃。

對(duì)于丙型肝炎來(lái)說(shuō)，由于缺少有效的疫苗，實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵在于廣泛開(kāi)展病毒核酸檢測(cè)，找到慢性患者，特別是無(wú)癥狀病毒攜帶者，積極進(jìn)行抗病毒治療。一個(gè)沒(méi)有丙型肝炎的新世界已經(jīng)出現(xiàn)在地平線上。這一美好愿景的實(shí)現(xiàn)，將為丙肝研究人員近半個(gè)世紀(jì)的艱苦努力樹(shù)立一座豐碑。這一群體的三位杰出代表——阿爾特、霍頓和萊斯——榮獲2020年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，自是實(shí)至名歸；然而每一獎(jiǎng)項(xiàng)每年最多三人獲獎(jiǎng)的規(guī)定，難免造成遺珠之憾。

在此之前的2016年，巴騰許拉格、萊斯和索非亞由于對(duì)丙肝病毒體外復(fù)制系統(tǒng)及治療藥物作出了杰出貢獻(xiàn)，共同獲得拉斯克臨床醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。頒獎(jiǎng)儀式上，萊斯分享了他認(rèn)識(shí)的一個(gè)家庭的故事。二十年前，這家一個(gè)幼小的女兒不幸感染了丙型肝炎。夫婦二人不知是否應(yīng)讓愛(ài)女接受副作用嚴(yán)重且療效不確定的干擾素治療。痛苦糾結(jié)之中，他們找到萊斯，征詢意見(jiàn)。最后夫婦二人決定暫緩治療，等待新療法的問(wèn)世。就在拉斯克獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)儀式的前一周，這對(duì)夫妻來(lái)信祝賀萊斯獲獎(jiǎng)，同時(shí)向他報(bào)喜：他們的女兒經(jīng)過(guò)新一代抗丙肝藥物的治療，已經(jīng)痊愈，結(jié)婚，家庭幸福，有了個(gè)一歲半的女兒，而且正懷著第二胎。“作為一個(gè)從事基礎(chǔ)研究的科學(xué)家，沒(méi)有一項(xiàng)褒獎(jiǎng)比這更大，來(lái)得更出人意料?！比R斯動(dòng)情地說(shuō)。

萊斯的真情表露，代表了廣大丙肝病毒研究人員的心聲。

主要參考資料

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2000 Lasker Clinical Medical Research Award. http://www.laskerfoundation.org/awards/show/hepatitis-c-virus-and-its-detection-in-blood-for-transfusions/.

2016 Lasker Clinical Medical Research Award. http://www.laskerfoundation.org/awards/show/hepatitis-c-replicon-system-and-drug-development/.

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原標(biāo)題：《肝神在上：誰(shuí)能拯救七千萬(wàn)慢性丙肝病患？》

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